雙酶法對(duì)烏賊眼中透明質(zhì)酸提取率的影響【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　雙酶法對(duì)烏賊眼中透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 食品質(zhì)

2、量與安全 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目　錄 </b>

3、;</p><p><b>　　1引言1 </b></p><p>　　1.1透明質(zhì)酸性質(zhì)1 </p><p>　　1.2透明質(zhì)酸提取現(xiàn)狀1</p><p>　　1.3本文的主要研究?jī)?nèi)容及意義2</p><p><b>　　2材料與方法2</b></

4、p><p>　　2.1材料與設(shè)備2</p><p>　　2.1.1材料2</p><p>　　2.1.2設(shè)備2</p><p><b>　　2.2方法2</b></p><p>　　2.2.1酶活力測(cè)定2</p><p>　　2.2.2葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制

5、作4</p><p>　　2.2.3透明質(zhì)酸粗品的制備工藝5</p><p>　　2.2.4 透明質(zhì)酸的純化工藝5</p><p>　　2.2.5 透明質(zhì)酸含量測(cè)定 5</p><p>　　2.2.6透明質(zhì)酸紫外光譜5</p><p>　　3 結(jié)果與討論5</p><p>

6、　　3.1中性蛋白酶的工藝條件5</p><p>　　3.2鏈霉菌蛋白酶酶解條件優(yōu)化5</p><p>　　3.2.1酶解時(shí)間6</p><p>　　3.2.2酶解溫度6</p><p>　　3.2.3 酶解PH 7</p><p>　　3.2.4 酶濃度8 </p><p>

7、;　　3.3酶法提取透明質(zhì)酸的正交試驗(yàn)8</p><p>　　3.4 透明質(zhì)酸紫外光譜9</p><p><b>　　4小結(jié)11</b></p><p><b>　　致謝12</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)13</b></p><

8、p><b>　　1</b></p><p>　　摘 要：透明質(zhì)酸是生物體內(nèi)普遍存在的酸性黏多糖，具有獨(dú)特的黏彈性、生物相容性及非免疫原性，在生命科學(xué)、食行業(yè)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用。本文對(duì)烏賊眼液進(jìn)行雙酶提取，首先使用4%中性蛋白酶在60°C下進(jìn)行4h的酶解，然后用鏈霉菌蛋白酶進(jìn)行二次酶解，再通過(guò)CTAB絡(luò)合，乙醇沉淀得到最終透明質(zhì)酸。 最后通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了鏈霉菌蛋

9、白酶提取透明質(zhì)酸的最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在酶用量6%，pH為7,酶解時(shí)間4h，酶解溫度為55℃時(shí)，此時(shí)透明質(zhì)酸的紫外吸光度為1.1970，得到的透明質(zhì)酸提取率為12.46% ，通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜對(duì)比可看出提取得到的透明質(zhì)酸純度較好。</p><p>　　關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸；提??；鏈霉菌蛋白酶；烏賊</p><p>　　Abstract：Hyaluronic acid is organi

10、sms widespread acidic sticky polysaccharide, has a unique viscoelastic, biocompatible and non-immunogenic, in life sciences, food industry and medical domain has a wide range of applications. In this paper, the two enzym

11、es extracted squid eye drops, first to conduct a neutral protease enzyme(enzyme concentration was 4% ,temperature of 60 °C, enzyme extraction time was 4h) using crude extract obtained by HA intermediate goods, then

12、a second protease enzyme Strept</p><p>　　Keywords: Hyaluronic acid; extraction; Streptomyces protease; squid </p><p><b>　　引言</b></p><p>　　1.1 透明質(zhì)酸性質(zhì)</p><p>

13、;　　透明質(zhì)酸是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元的高分子粘多糖，由于直鏈軸上單糖之間氫鍵的作用，透明質(zhì)酸分子在空間上呈剛性的螺旋柱型[1]，柱的內(nèi)側(cè)由于存在大量的羥基而產(chǎn)生強(qiáng)烈的親水性；同時(shí)羥基的連續(xù)定向排列，又在分子鏈上形成高度的憎水區(qū)，HA分子的親水和憎水特性，使得濃度低于1‰的HA也能形成連續(xù)的三維蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，水分子則在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)通過(guò)極性鍵和氫鍵與HA分子相結(jié)合，使得這些水在柱內(nèi)固定不動(dòng)，不易流失，HA親和吸

14、附的水分約為其本身重量的1000倍，這是其它粘多糖無(wú)法比擬的。</p><p>　　HA具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，它在有機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，具有特殊的保濕作用；分子量大的可在皮膚表面形成膜狀，起到比較強(qiáng)的保濕潤(rùn)滑作用，而且分子量小的ＨＡ還能被皮膚吸收進(jìn)入真皮層，促進(jìn)人體血液循環(huán)、改善中間代謝等，從而使皮膚變得光滑、柔嫩[2]，而且透明質(zhì)酸無(wú)致炎性及抗原性，是理想的“粘性手術(shù)”材料，對(duì)眼科、骨科手術(shù)

15、的完成和康復(fù)起重要作用[3]，所以被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥等方面。但是E. Gura[4]和T. Miyazaki*[5]等人的研究表明，透明質(zhì)酸的構(gòu)想受溫度、pH、外界機(jī)械剪應(yīng)力以及鹽濃度的影響，因此在獲得相對(duì)分子量分布帶比較窄的的透明質(zhì)酸時(shí)需要控制好各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件。 </p><p>　　1.2 透明質(zhì)酸提取現(xiàn)狀</p><p>　　透明質(zhì)酸廣泛分布于各種動(dòng)物組織中，而且不同的動(dòng)物組織中

16、得到的與細(xì)菌發(fā)酵得到得透明質(zhì)酸無(wú)種屬差異[6]。目前所了解的制備透明質(zhì)酸的方法主要有兩種，一種是從動(dòng)物組織中提取，一種是從微生物發(fā)酵液中提取[7]。國(guó)內(nèi)大多從雞冠以及動(dòng)物眼球等組織中提取透明質(zhì)酸。但是動(dòng)物組織提取法所得的HA的純度相對(duì)不是很高，而且生產(chǎn)效率低、成本高，其原料來(lái)源也受限制。雖然該法有很多缺陷，但它仍然是現(xiàn)今生產(chǎn)醫(yī)學(xué)用HA主要的方法[8]。</p><p>　　HA制備的方法目前主要有組織提取法、細(xì)菌

17、發(fā)酵法和人工合成法。</p><p>　　組織提取法的工藝流程比較簡(jiǎn)單，獲得的HA分子量也較大，一般大于60萬(wàn)，且其粘度高，保濕性能好。透明質(zhì)酸在動(dòng)物組織中的分布很廣泛，幾乎所有的動(dòng)物組織中都含有一定水平透明質(zhì)酸，只是含量不同而已。目前我們已從下列組織中分離出了透明質(zhì)酸：結(jié)締組織、臍帶、皮膚、人血清、雞冠、關(guān)節(jié)滑液、腦、軟骨、眼玻璃體、人尿、雞胚、兔卵細(xì)胞、動(dòng)脈和靜脈等，但考慮到原料中透明質(zhì)酸含量的高低、數(shù)量的多

18、少和提取難易的程度等因素的影響，能夠真正投于生產(chǎn)的原料主要為雞冠、人臍帶和動(dòng)物眼球，同時(shí)HA又還與硫酸軟骨素等粘多糖共存于生物組織中，這就導(dǎo)致了透明質(zhì)酸提純難度加大，生產(chǎn)成本也比較高[9-10]。</p><p>　　姚美琴等[11]采用水提醇沉，等電點(diǎn)法脫蛋白質(zhì)與超濾相結(jié)合的加工工藝，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，制備得到的透明質(zhì)酸為白色粉末，得率為 2.96% 。 </p><p&

19、gt;　　酶法提取一般有單酶提取和雙酶提取兩種，但由于蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵，因此為去除生成物中較長(zhǎng)的肽段在不改變糖鏈結(jié)構(gòu)的前提下，可先采用堿提法或Gdn-HCl抽提法[12—14], 再用兩種或兩種以上的酶水解, 能有效地提高粘多糖的得率。所得的多糖提取液有的因粘稠，常常用離心法除去不溶物。郭育濤[15]，趙玉紅[16]等人用胰蛋白酶水解動(dòng)物組織，得到純度較好的HA；汪建等[17]人采用粗胰蛋白酶水解雞冠，并分批次加入酶，

20、水解效果較好。此外常見(jiàn)的水解酶還有木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶、和鏈霉菌蛋白酶等。</p><p>　　酶法脫蛋白效果較好，損失率低，但酶解強(qiáng)度不宜過(guò)大、時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則易使太多多糖-蛋白質(zhì)的復(fù)合物分解，造成某些多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物特有的生理活性降低[18,19]</p><p>　　透明質(zhì)酸無(wú)種屬差異，不同動(dòng)物組織提取的透明質(zhì)酸，在化學(xué)本質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)上是一致的，只是相對(duì)分子質(zhì)量（Ｍr）有差別。

21、</p><p>　　本文的主要研究?jī)?nèi)容及意義</p><p>　　以烏賊眼球?yàn)樵咸崛⊥该髻|(zhì)酸方面的研究在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，而烏賊眼睛是一類(lèi)數(shù)量巨大的廢棄物，相對(duì)于其他魚(yú)眼較大，晶狀體所占體積也大。在水產(chǎn)品加工過(guò)程中產(chǎn)生大約15%-40%的下腳料，其中魚(yú)眼約占2-5%，所以如何從廢棄的烏賊眼球中提取透明質(zhì)酸，進(jìn)行科學(xué)的綜合利用，變廢為寶是一件非常有意義的事。本研究以烏賊魚(yú)眼為原料， 研究了烏

22、賊眼透明質(zhì)酸的提取工藝，使烏賊資源得以合理開(kāi)發(fā)利用，從而利于提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟(jì)附加值，變廢為寶。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)確定了最佳提取工藝：以透明質(zhì)酸得率為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)考察了酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度、酶用量對(duì)HA提取率的影響，并優(yōu)化了工藝參數(shù)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　

23、　2.1 材料和設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　烏賊：來(lái)自寧波莊市菜市場(chǎng)，清洗破碎，收集眼睛中的液體，除去泥沙、色素等沉淀后備用。 </p><p>　　中性蛋白酶（20萬(wàn)u/g，南寧龐博生物工程有限公司），鏈霉菌蛋白酶（4000　u/g，北京奇松生物有限公司進(jìn)口分裝），葡萄糖醛酸，其余試劑均

24、為分析純</p><p><b>　　2.1.2 設(shè)備</b></p><p>　　電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；冷凍高速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T6-新銳可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Cary100紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Varian公司。</p>

25、<p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 酶活力測(cè)定 [20]</p><p>　　2.2.1.1 試劑</p><p>　　福林試劑(Folin試劑)：于2000 mL磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100 g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25 g，

26、蒸餾水700 mL，85%磷酸50 mL，濃鹽酸100 mL，文火回流10 h。取去冷凝器，加入硫酸鋰(Li2SO4)50 g，蒸餾水50 mL，混勻，加入幾滴液體溴，再煮沸15 min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴溴液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000 mL，用細(xì)菌漏斗過(guò)濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。</p><p>　

27、　0.4 mol碳酸鈉溶液：稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)42.4 g，定容至1000 mL。</p><p>　　0.4 mol三氯乙酸(T C A)溶液：稱(chēng)取三氯乙酸(CCl3COOH) 65.4 g，定容至1000 mL。pH 7.2磷酸鹽緩沖液： 稱(chēng)取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol溶液(A液)。稱(chēng)取磷酸氫二鈉(Na2HPO4

28、3;12H2O) 71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol溶液(B液)。取A液28 mL和B液72 mL，再用蒸餾水稀釋1倍，即成0.1 mol pH 7.2的磷酸鹽緩沖液。</p><p>　　2% 酪蛋白溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取干酪素2 g，稱(chēng)準(zhǔn)至0.002 g，加入0.1 mol/L氫氧化鈉10 mL，在水浴中加熱使溶解(必要時(shí)用小火加熱煮沸)，然后用pH 7.2磷酸鹽緩沖液定容至100 mL即成。配

29、制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存。</p><p>　　100 μg/mL酪氨酸溶液:精確稱(chēng)取在105 ℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g，逐步加入6 mL 1 mol/L鹽酸使溶解，用0.2 mol/L鹽酸定容至100 mL，其濃度為1000 μg/mL，再吸取此液10 mL，以0.2 mol/L鹽酸定容至100 mL，即配成100 μg/mL的酪氨酸溶液。</p><p>　　2.

30、2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p><p>　　分別吸取不同濃度酪氨酸1 mL，各加入0.4 mol碳酸鈉5 mL，再各加入已稀釋的福林試劑1 mL。搖勻置于水浴鍋中。40 ℃保溫發(fā)色20 min在660 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。一般測(cè)三次，取平均值，同時(shí)做空白試驗(yàn)。</p><p>　　所得酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0115x+0.0145，相關(guān)系數(shù) R=0.9987，其中，Y：吸光

31、度；X：酪氨酸濃度(ug/mL)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。</p><p>　　圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 </p><p>　　Fig.1 Standard curve of enzyme activity</p><p>　　2.2.1.3 樣品測(cè)定</p><p>　　稱(chēng)取酶粉0.100 g，加入pH 7.2磷酸鹽緩沖液定容

32、至100 mL，吸取此液5 mL，再用緩沖液稀釋至25 mL，即成5000倍的酶粉稀釋液。取樣品稀釋液1 mL，置于40 ℃水浴中預(yù)熱2 min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min，時(shí)間到后，立即再各加入0.4 mol三氯乙酸2 mL，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過(guò)濾，然后另取濾液1 mL，再加0.4 mol碳酸鈉5 mL，已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20

33、 min后進(jìn)行光密度(OD)測(cè)定。空白試驗(yàn)測(cè)定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白。計(jì)算方法為在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。</p><p>　　樣品蛋白酶活力單位(干基) = ×4×N×</p><p><b>　　式中：</b></p&g

34、t;<p>　　A —由樣品測(cè)得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K)；</p><p>　　4 —4 mL反應(yīng)液取出1 mL測(cè)定(即4倍)；</p><p>　　N —酶液稀釋的倍數(shù)；</p><p>　　10 —反應(yīng)10 min；</p><p>　　W —樣品水分百分含量。</p>

35、<p>　　2.2.2 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作</p><p>　　2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作</p><p>　　精密稱(chēng)取葡糖醛酸(AR)20mg，置100ml量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻備用。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，分別加入10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，得10、20、30、40和50μg/ml濃度的對(duì)照品溶液。取6只具塞刻度試管分別

36、加入硼砂硫酸液5ml，置冰浴中冷至4℃左右。然后分別取空白溶液(蒸餾水)和不同濃度的對(duì)照品溶液各1ml加入試管中，先輕輕振搖，再充分混勻，并不斷用冰浴冷卻，將試管置沸水中加熱10min，置常水中冷至室溫。加入咔唑試劑0.2ml，混勻，水浴中再加熱15min，冷至室溫。在530nm處測(cè)定吸收度Ａ，以吸收度對(duì)濃度Ｃ作圖即可繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,或作直線回歸數(shù)據(jù)處理,計(jì)算出吸收度和濃度的線性回歸方程:C=b+kA，b－截距，k－斜率。</p&g

37、t;<p>　　所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0130x+0.0136，相關(guān)系數(shù) R=0.9963，其中，Y：吸光度；X：葡萄糖醛酸濃度(ug/mL)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。</p><p>　　圖2 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig.2 Standard curve of glucuronic acid</p><p>　　樣品的測(cè)定：

38、取待測(cè)樣品溶液 1mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出</p><p>　　相應(yīng)的葡糖醛酸濃度。按照下式計(jì)算得透明質(zhì)酸得率（以干重計(jì)）： </p><p>　　透明質(zhì)酸提取率（%）＝ （1）</p><p>　　2.2.2.2 樣品測(cè)定</p><p>　　取本品0.1g/L的溶液1ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法測(cè)定吸收

39、度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡糖醛酸濃度，按（1）式計(jì)算含量。</p><p>　　2.2.3 透明質(zhì)酸中間品的制備工藝 </p><p>　　烏賊眼液 →鹽提→中性蛋白酶一次酶解→雙氧水脫色→乙醇沉淀→沉淀真空冷凍干燥→透明質(zhì)酸中間品 </p><p>　　2.2.4 透明質(zhì)酸的純化工藝</p><p>　　透明質(zhì)酸中間品→溶解 →鏈霉菌

40、蛋白酶二次酶解→CTAB絡(luò)合→乙醇沉淀→沉淀真空冷凍干燥→透明質(zhì)酸多糖粗品 </p><p>　　2.2.4.1 鏈霉菌蛋白酶二次酶解</p><p>　　將透明質(zhì)酸中間品配置成5×10-3g/ml濃度的溶液，酶解時(shí)吸取10ml樣液置于錐形瓶中，與鏈霉菌蛋白酶在選擇的條件下充分反應(yīng)，然后沸水浴酶滅活10min，離心取上清液。 </p><p>　　2.2

41、.4.2 CTAB絡(luò)合</p><p>　　在所得的上清液中,加入等體積的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%的CTAB溶液,形成絮狀絡(luò)合物.靜置過(guò)夜,使絡(luò)合完全.以6000 r/min離心10 min,將沉淀溶于1.5 mol/L的NaCl溶液中,以相同條件離心除去不溶物.取上清液加3.5倍體積的95%濃度的乙醇使多糖沉淀。</p><p>　　2.2.5 透明質(zhì)酸含量測(cè)定</p><

42、;p>　　葡萄糖醛酸含量采用Bitter-Muir咔唑法測(cè)定，經(jīng)換算得到樣品中HA的含量。</p><p>　　2.2.6 透明質(zhì)酸紫外光譜</p><p>　　將上述純化得到的樣品溶解于水中，利用紫外分光光度計(jì)在紫外波長(zhǎng)下掃描。</p><p><b>　　3 結(jié)果和討論</b></p><p>　　3.1

43、中性蛋白酶的工藝條件</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)在中性蛋白酶與鏈霉菌蛋白酶雙酶解技術(shù)，首先將烏賊眼液先用0.2mol/L的NaCl溶液鹽提4h，加入4%的中性蛋白酶，在60°C下酶解4h，沸水浴中滅酶10min后，離心取上清液。加雙氧水脫色后用乙醇沉淀，然后將沉淀進(jìn)行冷凍干燥得到透明質(zhì)酸的中間品[21]。采用中性蛋白酶一次酶解效果較好，但是提取得到的透明質(zhì)酸的純度偏低。</p><p

44、>　　3.2 鏈霉菌蛋白酶酶解條件優(yōu)化</p><p>　　在中性蛋白酶酶解的基礎(chǔ)上使用鏈霉菌蛋白酶進(jìn)行二次酶解，并對(duì)影響鏈霉菌蛋白酶提取烏賊眼中透明質(zhì)酸的因素進(jìn)行重點(diǎn)研究。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)鏈霉菌蛋白酶提取透明質(zhì)酸的時(shí)間、溫度、pH值和酶添加量等因素進(jìn)行了優(yōu)化，選取酶解時(shí)間2-10h，pH值6.5-8.5，酶解溫度30-60℃與酶用量2-10%等條件，以HA提取率為考

45、察指標(biāo)進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定提取的最佳工藝條件。</p><p>　　3.2.1 酶解時(shí)間 </p><p>　　在鏈霉菌菌蛋白酶用量為1%，酶解溫度45℃，自然pH的條件下，在酶解時(shí)間2-10h范圍內(nèi)浸提，比較不同酶解時(shí)間對(duì)HA提取率的影響，以選擇最佳酶解時(shí)間。結(jié)果如圖3。</p><p>　　圖3 酶解時(shí)間對(duì)透明質(zhì)酸提取率的影響</p>&l

46、t;p>　　Fig.3 The influence of extraction time on the yielding rate of HA</p><p>　　圖3表明，酶解時(shí)間為4h時(shí)，透明質(zhì)酸提取率最高( 11.97%)，水解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，透明質(zhì)酸提取率反而下降。理論上講，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，酶解越充分，HA提取率越高，而當(dāng)酶濃度達(dá)到一定值時(shí)，酶促反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)并不能使提取率增加甚至?xí)鹣陆担@說(shuō)明在

47、4h時(shí)間里酶解反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行的較為充分。而且鏈霉菌蛋白酶具有高度專(zhuān)一性，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶可水解的肽鍵減少，同時(shí)蛋白酶活力以半衰期方式下降，而且時(shí)間太長(zhǎng)可能引起糖結(jié)構(gòu)變化甚至使碳環(huán)裂解，導(dǎo)致HA提取率下降。這在紫外吸收值中也得到了同樣的體現(xiàn)。</p><p>　　因此在酶解時(shí)間4h選定為最佳酶解時(shí)間。</p><p>　　3.2.2酶解溫度 </p><p>

48、　　在鏈霉菌菌蛋白酶用量為1%，在酶解時(shí)間為4h，自然pH的條件下，在酶解溫度30°C~60°C范圍內(nèi)浸提，比較不同酶解時(shí)間對(duì)HA提取率的影響，以選擇最佳酶解溫度。結(jié)果如圖4。</p><p>　　圖4 酶解溫度對(duì)透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　Fig.4 The influence of extraction temperature on the yield

49、ing rate of HA</p><p>　　由圖5可見(jiàn)，當(dāng)溫度達(dá)50℃，透明質(zhì)酸提取率最高(12.26%)，酶解效果最好。當(dāng)溫度高于50℃，透明質(zhì)酸提取率隨溫度的升高而呈下降的趨勢(shì)。一是因?yàn)闇囟壬?，酶逐漸變性；二是因?yàn)橥该髻|(zhì)酸在溫度高的條件下會(huì)發(fā)生降解，所以反應(yīng)溫度是透明質(zhì)酸提取率高低的一個(gè)重要參數(shù)，酶解溫度選取50℃。 </p><p>　　3.2.3 酶解PH值 </p&

50、gt;<p>　　在鏈霉菌菌蛋白酶用量為1%，在酶解時(shí)間為4h，在酶解溫度為45℃，pH在6.5~8.5范圍內(nèi)浸提，比較不同酶解PH 對(duì)HA提取率的影響，以選擇最佳酶解pH。結(jié)果如圖5。</p><p>　　圖5　pH值對(duì)透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　Fig.5 The influence of pH on the yielding rate of HA</

51、p><p>　　圖5表明，在pH 7.5左右提取率較高，說(shuō)明酶解作用存在一個(gè)最適pH值，在最適范圍內(nèi)提取率相差不大，偏離此pH值，酶的空間構(gòu)象就會(huì)改變，酶活力降低，甚至導(dǎo)致酶變性而失活。另外，酸性或堿性過(guò)強(qiáng)均會(huì)引起透明質(zhì)酸自身分解，從而導(dǎo)致透明質(zhì)酸的含量下降。因此在調(diào)試pH時(shí)，選擇PH7.5為最適合條件。</p><p>　　3.2.4 酶濃度 </p><p>　　

52、在酶解時(shí)間為4h，自然pH的條件下，在酶解溫度為 45°C，酶濃度2%~10% 范圍內(nèi)浸提，比較不同酶濃度下對(duì)HA提取率的影響，以選擇最佳酶濃度。結(jié)果如圖6。</p><p>　　圖6 酶用量對(duì)透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　Fig.6 The influence of enzyme amount on the yielding rate of HA</p>

53、<p>　　如圖6所示，當(dāng)酶濃度在2%~6%時(shí)，透明質(zhì)酸的提取率一直在增加，而6%酶濃度之后，透明質(zhì)酸的提取率表現(xiàn)出比較大的下降趨勢(shì)，因此6%的酶濃度作為酶解的最佳酶濃度。</p><p>　　酶添加量是影響HA提取率的重要因素，一般來(lái)說(shuō)，酶濃度越大反應(yīng)速率越快，HA的提取率也應(yīng)該隨之增加，但是在本次試驗(yàn)中，可能由于鏈霉菌蛋白酶的酶活性非常大，酶濃度在6%時(shí)達(dá)到了一種飽和狀態(tài)，過(guò)多的酶導(dǎo)致透明質(zhì)酸化

54、學(xué)鍵的不必要斷裂而引起透明質(zhì)酸含量的直接減少。 </p><p>　　3.3 酶法提取透明質(zhì)酸的正交實(shí)驗(yàn)</p><p>　　本試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察酶解時(shí)間、溫度、酶用量、酶解pH四因素對(duì)HA提取率的影響。利用L9（34）正交表作正交試驗(yàn)，選取因素水平和結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。</p><p>　　從表1可以看出，時(shí)間對(duì)透明質(zhì)酸提取率的影響最大，其次是

55、PH值，酶濃度和溫度影響均很小，酶法提取的最適工藝為: A2B1C2D3　，即鏈霉菌蛋白酶酶用量6%，pH為7，酶解時(shí)間4h，酶解溫度為55℃時(shí)，此時(shí)透明質(zhì)酸的紫外吸光度為1.1970，得到的透明質(zhì)酸提取率為12.46% 。</p><p>　　從表2的方差分析可以看出，時(shí)間對(duì)透明質(zhì)酸提取率有顯著的影響，加酶量、pH值和酶解溫度對(duì)透明質(zhì)酸提取率無(wú)顯著影響。</p><p>　　表1 正交

56、實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　Tab.1 Result of the orthogonal experiment</p><p>　　表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表</p><p>　　Tab.2 The result of analysis variance</p><p><b>　　注：＊為具有顯著性</b><

57、;/p><p>　　3.4 透明質(zhì)酸紫外光譜圖</p><p>　　圖9中的（a）圖為烏賊眼液經(jīng)過(guò)中性蛋白酶一次酶解后經(jīng)等電點(diǎn)去蛋白后得到的透明質(zhì)酸中間品稀釋25倍后的測(cè)量得到的紫外-可見(jiàn)光譜圖，峰出在205nm處，且其在260nm和280nm處有很明顯的核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰。圖（b）鏈霉菌蛋白酶二次酶解后稀釋25倍 測(cè)量得到的紫外可-見(jiàn)光譜圖，峰出在196處，與文獻(xiàn)中所描述的透明質(zhì)酸純品的

58、出峰點(diǎn)相同，且其雜質(zhì)峰也明顯變小。圖（c）是二次酶解后經(jīng)過(guò)CTAB絡(luò)合和乙醇沉淀后的HA的紫外-可見(jiàn)光譜圖，圖中可看出雜質(zhì)峰幾乎已經(jīng)消失。</p><p>　　由此可得，鏈霉菌蛋白酶的二次酶解對(duì)于透明質(zhì)酸純度有很大的影響，并且提純效果較好。</p><p>　?。╝） 經(jīng)過(guò)中性蛋白酶酶解得到的透明質(zhì)酸中間品的紫外-可見(jiàn)光譜</p><p>　　(b) 中間品經(jīng)過(guò)鏈

59、霉菌蛋白酶二次酶解后得到得紫外-可見(jiàn)光譜</p><p>　　(c) 二次酶解后經(jīng)CTAB絡(luò)合和醇沉后的HA紫外-可見(jiàn)光譜</p><p>　　圖9 透明質(zhì)酸的紫外-可見(jiàn)光譜</p><p>　　Fig .9 Ultraviolet spectra of hyaluronic acid</p><p><b>　　4 小結(jié)&l

60、t;/b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究了酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度和加酶量對(duì)透明質(zhì)酸提取率的影響，結(jié)果表明，采用中性蛋白酶一次酶解時(shí)的最佳工藝條件為：酶解時(shí)間為4h，酶解溫度60℃，加酶量為4%，PH為原液PH 6.6；采用鏈霉菌蛋白酶提取透明質(zhì)酸的最適工藝條件為：酶解時(shí)間為4h，酶解溫度50℃，加酶量為6%，酶解PH 7.5。在此條件下，得到的透明質(zhì)酸粗品為淺黃色無(wú)定形粉末，均無(wú)臭

61、，無(wú)味，提取率為14.10%，且樣品分子量及純度較高，有很大的發(fā)展前景。 </p><p>　　利用紫外-可見(jiàn)光譜分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)二次酶解后的HA純度增加，在260nm和280nm處核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰明顯變小。若進(jìn)行進(jìn)一步的處理可以使得透明質(zhì)酸不含蛋白質(zhì)和核酸雜質(zhì)。 參考文獻(xiàn) </p><p>　　[1] Evered D,Whelan J,eds.The biology of h

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