龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究以龍眼(Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi)“紅核子”松散型胚性愈傷組織(Friable embryogenic callus,FEC)為材料進(jìn)行了研究,內(nèi)容包括:(1)利用雙向凝膠電泳技術(shù)分離龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中的蛋白質(zhì),通過分析得到相關(guān)的差異或特異蛋白點(diǎn)；(2)對(duì)分離得到的差異或特異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,并對(duì)鑒定成功的點(diǎn)進(jìn)行功能分析；(3)通過研究不同濃度精胺(spermine)、

2、亞精胺(spermidine)、腐胺(putrescine)對(duì)龍眼松散型胚性愈傷組織生長狀況的影響,來探討龍眼FEC的生長和衰老機(jī)制,為FEC的培養(yǎng)、長期繼代以及胚性的保持提供科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果如下:
　　 1.龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中總蛋白點(diǎn)數(shù)目變化
　　 龍眼FEC生長過程中,雙向凝膠電泳圖譜顯示,總蛋白點(diǎn)數(shù)在400-800之間,總蛋白點(diǎn)數(shù)的變化趨勢呈先緩慢上升,再迅速下降,然后迅速上升,最后再平緩上升,雖中

3、間有大幅下降,但總體呈上升趨勢,到培養(yǎng)50d時(shí)達(dá)到最大值。下降的時(shí)期是在培養(yǎng)30d時(shí),并且數(shù)目變化劇烈。
　　 2.龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中總蛋白點(diǎn)等電點(diǎn)(pI)變化
　　 龍眼FEC生長過程中,蛋白質(zhì)等電點(diǎn)主要集中在4-7之間。其中pI在4-5和5-6范圍內(nèi)的蛋白點(diǎn)數(shù)目變化趨勢相似,都經(jīng)歷了一個(gè)先上升再緩慢下降又漸漸回升的變化過程,pI在5-6范圍的蛋白點(diǎn)數(shù)始終多于pI4—5范圍的蛋白數(shù)目,pI6-7的蛋白點(diǎn)數(shù)

4、基本呈相反變化,在10d-30d緩慢下降,在30d-40d時(shí)迅速上升,且超過pI范圍5-6的數(shù)目,之后又緩慢下降到與其接近的水平。
　　 3.龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中總蛋白點(diǎn)分子量(MW)變化
　　 龍眼FEC生長過程中,蛋白質(zhì)的分子量在14 KD-97 KD之間都有分布。而不同分子量范圍內(nèi)的蛋白點(diǎn)變化總體趨勢稍有不同,表達(dá)量相對(duì)較高的是分子量在30KD-45KD和45KD-66KD范圍的蛋白質(zhì),但是變化趨勢完全

5、相反,MW30KD-45KD的變化趨勢是先升高,后趨于平穩(wěn),MW45KD-66KD的變化趨勢是先下降,后趨于平穩(wěn)；分子量范圍14.4KD-20.1KD和20.1 KD-30 KD的蛋白數(shù)目變化趨勢基本相似,為先升高再降低再升高；66KD-97KD的大分子量蛋白質(zhì),變化趨勢不明顯,基本持平,后期略有下降。
　　 4.龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中15KD小分子量蛋白點(diǎn)數(shù)目變化
　　 龍眼FEC生長過程中,低于15KD的小

6、分子量蛋白數(shù)目在5-20之間,每個(gè)階段小分子量蛋白的比例不超過3％。整個(gè)生長過程中小分子量蛋白點(diǎn)數(shù)變化呈先降低,后持續(xù)升高,到不再變化。小分子量蛋白數(shù)目在總蛋白數(shù)中占的比例變化趨勢基本相似,呈先降低,后持續(xù)升高,再略微降低的趨勢。比例達(dá)到最高峰的時(shí)期是培養(yǎng)到40d時(shí),達(dá)到2.68％。
　　 5.龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中相關(guān)蛋白的功能分析
　　 龍眼FEC生長過程中質(zhì)譜鑒定成功的66個(gè)點(diǎn)(包括本實(shí)驗(yàn)室何園和賴呈純已

7、鑒定成功的18個(gè)點(diǎn))中除28.79％的功能未知蛋白,在已知功能的蛋白中,30.30％涉及脅迫應(yīng)答和抗氧化,12.12％涉及能量和糖代謝,9.09％涉及蛋白代謝和修復(fù),6.06％涉及細(xì)胞骨架重構(gòu),4.55％蛋白是調(diào)控蛋白,另外還有1.52％蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞凋亡相關(guān),1.52％蛋白與氨基酸代謝相關(guān),1.52％蛋白為脂類代謝相關(guān),3.03％是核酸代謝相關(guān)蛋白,1.52％蛋白是維生素代謝相關(guān)。
　　 6.龍眼松散型胚性愈傷組織生長過

8、程中相關(guān)蛋白表達(dá)變化
　　 龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中,脅迫反應(yīng)／氧化還原相關(guān)蛋白(抗壞血酸類過氧化物酶R147、R158和HC21,芐基醚還原酶同系物TH6、谷胱甘肽過氧化酶以及過氧化物酶L26)表達(dá)高峰出現(xiàn)在前期10-20d,而過氧化物酶4多在后期40-50d表達(dá)；蛋白質(zhì)合成及修復(fù)的相關(guān)蛋白,只有蛋白質(zhì)異形體1在10-30d表達(dá)量都很高,其他蛋白的表達(dá)高峰出現(xiàn)在前期10-20d之間,能量與糖代謝相關(guān)酶在整個(gè)過程中都有較

9、大量的表達(dá)。后期有與多胺前體合成相關(guān)的S-腺苷甲硫氨酸合成酶以及大量過氧化物酶的表達(dá),說明多胺不僅有類似抗氧化酶的功能可以清除活性氧,并且能夠提高抗氧化酶的活性。
　　 7.多胺對(duì)龍眼松散型胚性愈傷組織生長狀況的影響
　　 鑒于蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)與多胺相關(guān)的酶,與多胺在植物中的合成及抗衰老作用相關(guān),因此進(jìn)一步研究了添加不同濃度精胺、亞精胺和腐胺等多胺對(duì)龍眼FEC的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),后期生長到40d時(shí),各培養(yǎng)基中的龍眼F

10、EC從外觀上看幾乎已經(jīng)全部褐變,但是部分培養(yǎng)條件的FEC生長量和細(xì)胞活力還在增加,沒有降低。生長到40d,spm添加濃度為1mg／L、7mg／L、9mg／L時(shí),龍眼FEC生長量仍有大幅上升,幅度超過對(duì)照。spm濃度為3mg／L、5mg／L時(shí),細(xì)胞活力繼續(xù)上升；添加spd濃度為3mg／L和7mg／L的培養(yǎng)基中,龍眼FEC的生長量繼續(xù)大幅度增長,9mg／L的培養(yǎng)基中的FEC的細(xì)胞活力依然有上升趨勢；培養(yǎng)基中添加put濃度為9mg／L時(shí),龍眼