櫻桃谷鴨CD8α胞外區(qū)多肽的原核表達(dá)、抗體制備及初步應(yīng)用.pdf_第1頁(yè)
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1、本試驗(yàn)通過(guò)克隆測(cè)序櫻桃谷鴨和麻鴨CD8αORF基因,應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析得出櫻桃谷鴨與人的CD8α胞外區(qū)的氨基酸相似形比較大。利用克隆表達(dá)技術(shù)對(duì)櫻桃谷鴨的CD8α胞外區(qū)基因進(jìn)行表達(dá),制備兔抗櫻桃谷鴨CD8α多克隆抗體,同時(shí)應(yīng)用SABC免疫組化方法觀測(cè)鴨的外周血的CD8+T細(xì)胞變化規(guī)律,為鴨細(xì)胞免疫方面的研究提供手段,其主要研究?jī)?nèi)容如下。
   1櫻桃谷鴨和麻鴨CD8αORF的克隆測(cè)序及序列分析
   本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)已

2、公布北京鴨CD8α開(kāi)放閱讀框基因序列特征設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性的引物,克隆了櫻桃谷鴨和麻鴨CD8α基因,并公布了櫻桃谷鴨和麻鴨的序列,其登錄號(hào)分別為FJ527828和FJ528914。通過(guò)相關(guān)軟件分析了不同種屬動(dòng)物其基因特征得出,櫻桃谷鴨與麻鴨和北京鴨的CD8α氨基酸序列相互之間相似性差異最大的在胞外區(qū),而其他區(qū)域相對(duì)保守;由以上分析結(jié)果,本人選取了差異性比較大的胞外區(qū)又進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)櫻桃谷鴨、麻鴨和人CD8α胞外區(qū)親水性、抗原性以及該區(qū)域

3、在蛋白質(zhì)表面的功能都有明顯差異。
   2櫻桃谷鴨CD8α胞外區(qū)的原核表達(dá)
   由上面的基因比較之后,本人針對(duì)差異性比較大的胞外區(qū),設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物,用來(lái)克隆其區(qū)域基因。同時(shí)還對(duì)此基因序列構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-DuCD8α,在E.coliBL21中通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,在蛋白質(zhì)電泳中43.8KDa位置處出現(xiàn)了明顯的的蛋白條帶;通過(guò)Western

4、-blot分析在融合標(biāo)簽蛋白大約43.8Kda處有明顯的抗原條帶出現(xiàn),證實(shí)本人對(duì)櫻桃谷鴨CD8α胞外區(qū)多肽成功表達(dá)了。
   3抗櫻桃谷鴨CD8α胞外區(qū)多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用
   對(duì)表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行純化后作為免疫原,將與所獲得的兔抗鴨免疫血清作為一抗,通過(guò)ELISA方法測(cè)定了兔抗rDuCD8α抗體效價(jià)為1:51200。在鴨瘟病毒感染后,非感染組CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比為29-32%,處于一個(gè)相

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