櫻桃谷鴨CD8α胞外區(qū)多肽的原核表達(dá)、抗體制備及初步應(yīng)用.pdf

1、本試驗(yàn)通過克隆測序櫻桃谷鴨和麻鴨CD8αORF基因，應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測分析得出櫻桃谷鴨與人的CD8α胞外區(qū)的氨基酸相似形比較大。利用克隆表達(dá)技術(shù)對櫻桃谷鴨的CD8α胞外區(qū)基因進(jìn)行表達(dá)，制備兔抗櫻桃谷鴨CD8α多克隆抗體，同時(shí)應(yīng)用SABC免疫組化方法觀測鴨的外周血的CD8+T細(xì)胞變化規(guī)律，為鴨細(xì)胞免疫方面的研究提供手段，其主要研究內(nèi)容如下。
　　 1櫻桃谷鴨和麻鴨CD8αORF的克隆測序及序列分析
　　 本試驗(yàn)通過對已

2、公布北京鴨CD8α開放閱讀框基因序列特征設(shè)計(jì)了一對特異性的引物，克隆了櫻桃谷鴨和麻鴨CD8α基因，并公布了櫻桃谷鴨和麻鴨的序列，其登錄號分別為FJ527828和FJ528914。通過相關(guān)軟件分析了不同種屬動(dòng)物其基因特征得出，櫻桃谷鴨與麻鴨和北京鴨的CD8α氨基酸序列相互之間相似性差異最大的在胞外區(qū)，而其他區(qū)域相對保守；由以上分析結(jié)果，本人選取了差異性比較大的胞外區(qū)又進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)櫻桃谷鴨、麻鴨和人CD8α胞外區(qū)親水性、抗原性以及該區(qū)域

3、在蛋白質(zhì)表面的功能都有明顯差異。
　　 2櫻桃谷鴨CD8α胞外區(qū)的原核表達(dá)
　　 由上面的基因比較之后，本人針對差異性比較大的胞外區(qū)，設(shè)計(jì)一對特異性的引物，用來克隆其區(qū)域基因。同時(shí)還對此基因序列構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-DuCD8α，在E.coliBL21中通過對轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，在蛋白質(zhì)電泳中43.8KDa位置處出現(xiàn)了明顯的的蛋白條帶；通過Western

4、-blot分析在融合標(biāo)簽蛋白大約43.8Kda處有明顯的抗原條帶出現(xiàn)，證實(shí)本人對櫻桃谷鴨CD8α胞外區(qū)多肽成功表達(dá)了。
　　 3抗櫻桃谷鴨CD8α胞外區(qū)多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用
　　 對表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行純化后作為免疫原，將與所獲得的兔抗鴨免疫血清作為一抗，通過ELISA方法測定了兔抗rDuCD8α抗體效價(jià)為1:51200。在鴨瘟病毒感染后，非感染組CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比為29-32％，處于一個(gè)相