綿羊肺腺瘤病毒CA基因的克隆表達(dá)及間接競爭ELISA方法的建立.pdf

1、綿羊肺腺瘤病(OPA)是由外源性的綿羊肺腺瘤病毒(exJSRV)引起的羊肺臟和支氣管上皮細(xì)胞的癌變.該病的特征性癥狀是在肺部產(chǎn)生大量的泡沫狀液體，當(dāng)羊低頭或“小推車”試驗時液體從鼻孔流出，羊一旦出現(xiàn)該臨床癥狀后會在數(shù)日內(nèi)死亡或在運動、寒冷刺激后突然死亡。OPA早在19世紀(jì)早期就已發(fā)現(xiàn).發(fā)病年齡為2月齡-11歲齡（以2-4歲齡為主），對種羊危害極為嚴(yán)重，目前尚無有效阻止該病傳播的方法，給許多國家的綿羊養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失。感染OPA的羊體

2、內(nèi)檢測不出針對JSRV的循環(huán)抗體或T淋巴細(xì)胞應(yīng)答.使得OPA檢測只能限定在抗原檢測上，然而至今國內(nèi)外范圍內(nèi)都未發(fā)現(xiàn)能讓該病毒在體外高效穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，也未分離出JSRV的純病毒，這給該病的實驗室診斷、疫苗及特異性藥物的研制造成了極大的困難，也給JS RV分子生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究造成了困難。OPA不僅是重要的獸醫(yī)學(xué)問題，也為上皮細(xì)胞瘤（如人類的肺癌）以及HIV的分子生物學(xué)研究提供了新的模型，因此建立一種準(zhǔn)確、簡便的診斷方法來對該病作出

3、準(zhǔn)確診斷具有積極的研究意義。
　　 本研究根據(jù)JSRV衣殼蛋白(CA)基因序列設(shè)計特異性引物，以O(shè)PA自然感染的綿羊肺臟總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后克隆至pEASY載體中，經(jīng)測序正確后與pET28a質(zhì)粒連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒6CA66028a1，對測序正確的陽性表達(dá)質(zhì)粒用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE分析正確后，優(yōu)化表達(dá)條件并進(jìn)行大量誘導(dǎo)和純化，用純化后的重組CA蛋白作為包被抗原，用從羊肺臟組織和血液中提取的病毒與其競爭重

4、組蛋白制備的兔免疫血清，初步建立了間接競爭ELISA方法并對該方法進(jìn)行優(yōu)化確定最佳反應(yīng)條件。原核表達(dá)結(jié)果顯示，當(dāng)IPTG終濃度為0.4mmol/L，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時間為5h重組蛋白表達(dá)量最大，重組蛋白分子量約為28kDa，主要以上清形式表達(dá)，重組蛋白免疫所得兔免血清為國內(nèi)首段能與天然JSRV結(jié)合的抗CA段完整重組蛋白，為進(jìn)一步建立JSRV的ELISA方法奠定了基礎(chǔ);競爭ELISA結(jié)果顯示，當(dāng)抗原包被濃度為2μg/ml，一抗稀釋度

5、為1∶2000，以1％BSA(PBST)作為封閉液封閉1h，一抗和病毒混合45min，包被蛋白與一抗混合液競爭40min，二抗稀釋度為1∶1600，二抗孵育45min，TMB顯色12min為最優(yōu)。本研究初步在實驗室建立了JSRV的競爭ELISA檢測方法。
　　 為了解黑龍江的澳大利亞進(jìn)口綿羊、黑龍江省內(nèi)及與黑龍江毗鄰的內(nèi)蒙地區(qū)OPA感染情況，及初步建立好的間接競爭ELISA方法實際臨床使用價值，本研究對23只黑龍江澳大利亞進(jìn)口綿