牛支原體p28基因的表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、Mycoplasma boris是感染牛的一種重要致病性病原體,主要引起牛肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、角膜結(jié)膜炎等疾病,給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了很嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國于2008年首次報(bào)道了M.bovis肺炎,該病原日益成為危害我國養(yǎng)牛業(yè)的重要因素。目前M.bovis無國際公認(rèn)的特異性診斷方法,這給該疾病的防控帶來困難。研究具有自主知識產(chǎn)權(quán)的M.bovis血清抗體ELISA試劑盒意義深遠(yuǎn)。本研究建立了M.boris血清抗體檢測ELISA方法并組裝為試

2、劑盒,填補(bǔ)了國內(nèi)M.bovis ELISA試劑盒的空白。
　　 本實(shí)驗(yàn)的工作基礎(chǔ):本實(shí)驗(yàn)室完成了對M.bovis Hubei分離株全基因組的測序,利用生物信息學(xué)軟件分析尋找到58個(gè)假定膜表面蛋白候選基因,通過PCR、構(gòu)建重組質(zhì)粒以及原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白,用免疫學(xué)方法證明了一個(gè)編號為“P28”的重組蛋白具有免疫原性。
　　 本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)得到重組蛋白,將純化后的P28重組蛋白作為抗原建立M.bovis血清抗體間

3、接ELISA方法并組裝成診斷試劑盒,命名為“MbH試劑盒”。首先,從不同批次MbH試劑盒中隨機(jī)抽取用于試劑盒的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性、可檢測宿主抗體持續(xù)期、重復(fù)性和穩(wěn)定性性能評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MbH試劑盒的敏感性為93.04％,特異性為97.80％,與牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)陽性血清等牛源性其它疾病陽性血清無交叉反應(yīng)；MbH試劑盒檢測結(jié)果與病原學(xué)和血清學(xué)診斷結(jié)果總體符合率為95.41％；MbH試劑盒可檢測到感染發(fā)生一周后至的20周后

4、的M.bovis血清抗體；可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MbH試劑盒批間變異系數(shù)與批內(nèi)變異系數(shù)均小于10％；保存期試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Mbt{試劑盒可在4℃封閉條件下保存14個(gè)月。其次,用已知血清樣品對MbH試劑盒與其他兩種進(jìn)口商品化試劑盒(“Kit1”和“Kit2”)進(jìn)行比較,考察MbH試劑盒與商品化試劑盒在敏感性、特異性、準(zhǔn)確性指標(biāo)的優(yōu)劣以及3種試劑盒的一致性,結(jié)果表明:本實(shí)驗(yàn)室研制的MbH試劑盒敏感性與商品化試劑盒Kit1相當(dāng)；特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

5、MbH試劑盒與Kit1與CBPP標(biāo)準(zhǔn)陽性血清無交叉反應(yīng),而Kit2與標(biāo)準(zhǔn)CBPP陽性血清存在交叉反應(yīng)；選取已知血清樣品對MbH試劑盒與Kit1進(jìn)行比較,結(jié)果表明MbH試劑盒與Kit1檢測結(jié)果與綜合診斷結(jié)果(包括病原學(xué)和血清學(xué)診斷)的符合率分別達(dá)到92％和96％,而Kit2檢測結(jié)果與綜合檢測結(jié)果符合率僅為74.67％；一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示MbH試劑盒與Kit1有極強(qiáng)的一致性,而Kit2與MbH試劑盒之間、Kit2與Kit1之間有中度的一致性