免疫細(xì)胞分離技術(shù)終概要

1、免疫細(xì)胞分離技術(shù)（針對(duì)淋巴細(xì)胞）,41110111 向珍娟41110124 龔琦青41110131 周武,免疫細(xì)胞分離技術(shù)的意義,我們知道進(jìn)行有關(guān)細(xì)胞免疫方面的檢測(cè)，特別是有關(guān)免疫細(xì)胞功能的體外實(shí)驗(yàn)，往往須將待檢淋巴細(xì)胞從血液或組織中分離出來(lái)，而外周血會(huì)有多種細(xì)胞成分，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和血咆群體。但有些細(xì)胞如淋巴細(xì)胞的物理特性及生化特性與其他細(xì)胞差異甚微，用簡(jiǎn)單的方法不容易分純，因此產(chǎn)生了專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞分

2、離純化技術(shù)。,白細(xì)胞分離吞噬細(xì)胞的分離和收集淋巴細(xì)胞分離,白細(xì)胞的分離,自然沉降法聚合物加速沉降法,自然沉降法,采集血液,,試管直立靜置室溫（30~60min）,抗凝（如加肝素）,,,血漿層,白細(xì)胞層,紅細(xì)胞層,,吸管吸取白細(xì)胞層,置新試管中,,離心,棄上清并洗滌,,加蒸餾水,低滲處理（裂解紅細(xì)胞）,,反復(fù)洗滌,得純度較高的白細(xì)胞懸液,聚合物加速沉降法,本法是利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（PVP）等

3、使紅細(xì)胞凝集成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之與白細(xì)胞分離。優(yōu)點(diǎn)：本法的細(xì)胞獲得率比自然沉降法高。,吞噬細(xì)胞的分離和收集,方法：斑蝥敷貼法操作：用濾紙蘸取10％中藥斑蝥酒精浸出液，貼敷在臂內(nèi)側(cè)皮膚表面，4～5h后皮膚局部充血，48h后局部形成水皰，吸取皰中的組織液，內(nèi)含巨噬細(xì)胞；優(yōu)點(diǎn)：可從人體組織液中獲取較純的巨噬細(xì)胞，不需作進(jìn)一步體外分離，細(xì)胞量損失較少；缺點(diǎn)：此法對(duì)病人皮膚有一定損傷，有時(shí)可引起局部感染，應(yīng)慎用。,2024/1/2

4、2,淋巴細(xì)胞分離三步走,（一）外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離（二）純淋巴細(xì)胞群的采集（三）淋巴細(xì)胞亞群的分離,（一）外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離,外周血中單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075～1.090，血小板為1.030～1.035。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密

5、度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。,Ficoll 分層液法,外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離,Ficoll 分層液法 Percoll 分層液法,分層液,基本要求 ①對(duì)細(xì)胞無(wú)毒 ②基本等滲 ③不同于血漿等分離物質(zhì) ④有一定的比重最佳選擇（目前） Ficoll（聚蔗糖-泛影葡胺溶液）： 2份6％聚蔗糖蒸餾水溶液+1份34%泛影葡胺生理鹽水溶液組成，其比重為1.077±0.00

6、2.,分離過(guò)程,（1）分層液置試管底層（2）肝素抗凝全血以Hanks 液或PBS 液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個(gè)清晰的界面（3）水平式離心（4）不同層次的液體和細(xì)胞帶（5）吸取單個(gè)核細(xì)胞層,Ficoll 分層液法,分離成品：淋巴細(xì)胞 單核細(xì)胞分離純度：95%左右，其中淋巴細(xì)胞約占90%~95%,Percoll 分層液法,Percoll分離液法是一種連續(xù)

7、密度梯度離心分離法。Percoll 是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。Percoll 液經(jīng)高速離心后可形成一個(gè)連續(xù)的密度梯度，不同密度的細(xì)胞將懸浮于各自不同的密度區(qū)帶，從而將密度不等的細(xì)胞分離純化。,分離過(guò)程,（1）用Percoll原液(密度1．135)與約等量的磷酸緩沖液均勻混合（2）高速離心后，形成一個(gè)從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度（3）將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液輕輕疊加在液面上（4）低速離

8、心后，得四個(gè)細(xì)胞層。表層為死細(xì)胞殘片和 血小板，底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，中間有兩層，上層富含單核細(xì)胞(78％)，下層富含淋巴細(xì)胞(98％）。,Percoll分層液法,優(yōu)點(diǎn)：純化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；缺點(diǎn)：操作流程較長(zhǎng)，手續(xù)較多。,連續(xù)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞中各細(xì)胞成分的分布示意圖,（二）純淋巴細(xì)胞的分離,根據(jù)密度離心分離法獲得的淋巴細(xì)胞主要混合在單個(gè)核細(xì)胞懸液中，由于淋巴細(xì)胞在數(shù)量上占單個(gè)核細(xì)胞的大多數(shù)，因此，單個(gè)核細(xì)胞有時(shí)也可以

9、大致地代表淋巴細(xì)胞直接用于某些實(shí)驗(yàn)，但嚴(yán)格地講，采用上述方法獲得的單個(gè)核細(xì)胞需去除單核細(xì)胞才能較為準(zhǔn)確地代表淋巴細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。,純淋巴細(xì)胞群的采集,實(shí)驗(yàn)原理：利用單核細(xì)胞在37℃和Ca2+存在條件下，能主動(dòng)粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性；實(shí)驗(yàn)方法：粘附貼壁法 吸附柱過(guò)濾法 磁鐵吸引法,2024/1/22,粘附

10、貼壁法,將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。缺點(diǎn)：因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。,2024/1/22,吸附柱過(guò)濾法,將單個(gè)核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗

11、脫下來(lái)的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞；優(yōu)點(diǎn)：此法簡(jiǎn)單易行，對(duì)細(xì)胞極少損害。,2024/1/22,磁鐵吸引發(fā)法,原理：利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性；操作：在單個(gè)核細(xì)胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內(nèi)短時(shí)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞。,2024/1/22,（三）淋巴細(xì)胞亞群的分離,原則：根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化；陽(yáng)性選擇法：凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志

12、選擇純化所需細(xì)胞的方法；陰性選擇法：選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞的方法；,2024/1/22,淋巴細(xì)胞亞群的分離,通過(guò)以上兩步的實(shí)驗(yàn)分離操作，我們得到純度比較高的淋巴細(xì)胞混合液。然而在具體的實(shí)驗(yàn)操作中，我們還需要將淋巴細(xì)胞進(jìn)一步的進(jìn)行分離。原則：根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化；陽(yáng)性選擇法：凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法；陰性選擇法：選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞的方法；,分離方法,

13、1. E花環(huán)沉降法2. 尼龍毛分離法3. 免疫吸附分離法4. 免疫磁性微珠分離法5. 流式細(xì)胞儀分離法,E花環(huán)沉降法,基本原理：T 細(xì)胞有羊紅細(xì)胞受體(E受體)，可以與羊紅細(xì)胞結(jié)合形成較大的E 花環(huán)的特性，可將T 細(xì)胞和B 細(xì)胞分離。,分離過(guò)程,（1）將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合（2）淋巴細(xì)胞形成E 花環(huán)（3）用淋巴細(xì)胞分層液分離（4）浮懸在分層界面的細(xì)胞群則富含B 細(xì)胞，而T 細(xì)胞由于與羊紅細(xì)胞結(jié)合形成E 花環(huán)后

14、比重較大，則沉降在管底相關(guān)拓展：用神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理羊紅細(xì)胞將有利于花環(huán)的形成和增加穩(wěn)定性。另外將沉降在管底與羊紅細(xì)胞結(jié)合的T 細(xì)胞經(jīng)低滲法處理可使圍繞細(xì)胞周?chē)木d羊紅細(xì)胞快速裂解，又可得到E 受體陽(yáng)性的T細(xì)胞群。,,,尼龍毛分離法,原理：本法利用B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，可將T和B細(xì)胞分開(kāi)。操作方法：取松散而經(jīng)過(guò)處理的尼龍毛（聚酰胺纖維），均勻充填在內(nèi)徑5～6nm的聚乙烯塑料管（飲料管即可）內(nèi)，經(jīng)Hanks液浸

15、透保溫，將單個(gè)核細(xì)胞懸液加入柱內(nèi)，放37℃溫箱靜置1～2h。用預(yù)溫的含10％～20％小牛血清培養(yǎng)液灌洗，洗脫液內(nèi)含有非粘附的T細(xì)胞，重復(fù)灌洗幾次以除去管內(nèi)殘留的T細(xì)胞。再用冷或溫培養(yǎng)液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時(shí)洗脫液內(nèi)富含B細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：如此得到的T細(xì)胞純度在90％以上，B細(xì)胞純度可達(dá)80％。,2024/1/22,免疫吸附分離法----親和板結(jié)合分離法,原理：各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，

16、凡抗原陽(yáng)性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲??；,2024/1/22,親和板結(jié)合分離法,同樣若用特異性抗原交聯(lián)在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時(shí)，本法更適用。如要分離CD4+或CD8+細(xì)胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細(xì)胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細(xì)胞

17、。,2024/1/22,親和板結(jié)合分離法（陽(yáng)性選擇法）,（1）將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上（2）加細(xì)胞懸液（3）各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同抗原性的特點(diǎn)和表面標(biāo)志，抗原陽(yáng)性的細(xì)胞與相應(yīng)的固相抗體結(jié)合，吸附在平板上（3）多次細(xì)胞洗滌后我們將得到吸附在平板上的抗原陽(yáng)性細(xì)胞（4）同理若用特異性抗原交聯(lián)于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。但淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞

18、群時(shí)，即將其用于陰性選擇，本法更合適。,2024/1/22,免疫磁珠法分離細(xì)胞原理：,免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。免疫磁珠法分為陽(yáng)性分離法和陰性分離法：    陽(yáng)性分離法－磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲

19、得的細(xì)胞    陰性分離法－磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于磁場(chǎng)的細(xì)胞為所需細(xì)胞。,熒光激活細(xì)胞分離儀(FACS)分離法,主要原理是細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過(guò)高速流動(dòng)系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測(cè)區(qū)進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)細(xì)胞從流動(dòng)室噴嘴處流出時(shí)，超聲振蕩攪動(dòng)液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（40000個(gè)/s），每小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞（其中只有百分之幾的液滴中含細(xì)胞），細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，

20、轉(zhuǎn)換成脈沖信號(hào)，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞的類(lèi)型。如識(shí)別的是預(yù)計(jì)所需的細(xì)胞時(shí)（如T細(xì)胞、B細(xì)胞要其亞群），在細(xì)胞樣品流斷裂成小滴時(shí)，使液滴瞬即感應(yīng)陽(yáng)電荷、陰電荷或不帶電荷，使所需的細(xì)胞在電場(chǎng)偏轉(zhuǎn)下進(jìn)入不同的收集管;優(yōu)點(diǎn)：用FACS分離細(xì)胞準(zhǔn)確快速，能保持細(xì)胞活力，并可在無(wú)菌條件下進(jìn)行；局限：儀器昂貴，極少用于常規(guī)，而多數(shù)僅作為研究的手段,2024/1/22,2024/1/22,熒光激活細(xì)胞分離儀,整體分離結(jié)果,至此，通過(guò)細(xì)胞分離技術(shù)，