他汀類藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的遺傳藥理學(xué)研究.pdf

1、他汀類藥物(statins)能夠明顯降低低密度脂蛋白膽固醇，從而降低冠心病的發(fā)病率和心血管事件的發(fā)生，臨床上廣泛被用作預(yù)防心血管疾病的一線藥物。目前最新的兩種他汀類藥物為羅蘇伐他汀(rosuvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)，與早期上市的幾種常用他汀類藥物(洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀和阿伐他汀)相比，由于其較低劑量即可達(dá)到更顯著的效果而被稱為“超級他汀”。研究表明多種他汀類藥物都存在著代謝和反應(yīng)的個體及

2、種族間差異。這些差異的產(chǎn)生主要是遺傳因素決定的，雖然環(huán)境因素也參與了共同的作用。與藥物代謝酶、藥物受體的變異相比，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的變異是造成他汀類藥物反應(yīng)個體差異更重要的因素。轉(zhuǎn)運(yùn)體的遺傳變異導(dǎo)致自身功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致對其底物的轉(zhuǎn)運(yùn)作用發(fā)生改變。本研究旨在研究他汀類藥物反應(yīng)個體差異的分子機(jī)制，從而更好的避免與劑量相關(guān)的藥物毒副反應(yīng)，為最終實(shí)現(xiàn)臨床藥物治療中的個體化用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 在影響他汀類藥物處置的轉(zhuǎn)運(yùn)體中，從臨床試驗(yàn)已經(jīng)得到

3、證實(shí)的有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1(OATP1B1，又名LST1，OATP-C，OATP2)，OATP1B1是一種特異性分布于肝細(xì)胞基底膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，編碼基因?yàn)镾LCO181，此外還有乳腺癌耐藥蛋白(broast cancer resistanceprotein,BCRP)，它是ATP結(jié)合盒(adenosine triphosphate-bindingcassette,ABC)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員，定位于染色體4q22，編碼一個633

4、氨基酸的蛋白，主要以亞細(xì)胞水平在胎盤、乳房、肝細(xì)胞、內(nèi)皮組織的細(xì)胞項(xiàng)面表達(dá)。為了對轉(zhuǎn)運(yùn)體在藥物處置中的作用進(jìn)行分離研究，本課題主要研究了三種基本不經(jīng)過體內(nèi)代謝酶代謝的他汀——普伐他汀、羅蘇伐他汀、匹伐他汀，這三種他汀均為OATP1B1的良好底物。這幾種他汀分別代表了早期的他汀藥物和最新的兩種他汀類藥物，他們經(jīng)由轉(zhuǎn)運(yùn)體的攝取和被動擴(kuò)散從基底膜進(jìn)入肝細(xì)胞，然后從肝細(xì)胞頂面泵出，目前已知，在攝取過程中起重要作用的OATP1B1的A388G點(diǎn)突

5、變和T521C點(diǎn)突變分別導(dǎo)致蛋白第130位和174位氨基酸殘基產(chǎn)生Asn→Asp和Val→Ala替代，形成*1b(Ash130Asp)，*5(Val174Ala)和*15單倍型(A388G and T521C，Asn130Asp and Val174Ala)三種突變型，其中*15對于他汀類藥物的藥代動力學(xué)參數(shù)有顯著影響，而在泵出轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究中，較新的研究表明，BCRP的C421A位點(diǎn)多態(tài)性性會導(dǎo)致羅蘇伐他汀的血藥濃度顯著變化，多藥抗藥性

6、相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)家族中的Multidrug Resistance-associated Protein 2的C1446G位點(diǎn)突變則可以引起普伐他汀的血藥濃度顯著變化。 研究表明，在藥物被轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中，藥物本身的理化特性會影響到藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，通常來講，Log P(辛醇/水分配系數(shù))值高(脂溶性高)的藥物更容易通過被動擴(kuò)散的方式跨過細(xì)胞膜，而水溶性強(qiáng)

7、的藥物的跨膜過程更多的依賴轉(zhuǎn)運(yùn)體或受體介導(dǎo)的方式。體外研究發(fā)現(xiàn)，對于高脂溶性的辛伐他汀(log P=4.4)的跨膜運(yùn)輸來說，OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)體起到的作用比被動擴(kuò)散的作用要小的多，由于阿伐他汀(log P=1.53)和西立伐他汀(log P=2.32)適度的脂溶性，只有部分經(jīng)被動擴(kuò)散入胞，而普伐他汀(log P=-0.47)由于其高水溶性，其跨膜的運(yùn)輸主要經(jīng)由轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)。然而對于相似脂溶性的匹伐他汀(log P=1.5)和氟伐他汀(lo

8、g P=1.75)，OATP1B1的多態(tài)性卻對此二者的藥代動力學(xué)產(chǎn)生了顯著不同的影響。由于普伐他汀是OATP1B1的水溶性底物，但與OATP1B1的親和力較低，(Km=85.7μM)，而匹伐他汀是OATP1B1的脂溶性底物(log P=1.5)，與OATP1B1的親和力明顯高(Km=3.0μM)于普伐他汀，氟伐他汀的體外攝取試驗(yàn)研究極少，本課題中選擇普伐他汀、匹伐他汀和氟伐他汀，從藥物自身理化特性和其與轉(zhuǎn)運(yùn)體親和力的角度，通過體外試驗(yàn)和

9、臨床試驗(yàn)相結(jié)合的方式研究并解釋了此現(xiàn)象。 羅蘇伐他汀主要經(jīng)OATP1B1攝取入肝細(xì)胞，而在其泵出肝臟細(xì)胞過程中，BCRP起到重要作用，益肝靈又名利肝隆(silymarin)，是一種臨床常用的護(hù)肝藥物，近年的不少體外研究表明，silymarin既是OATP1B1的抑制劑，又是BCRP的抑制劑，由于OATP1B1與BCRP在羅蘇伐他汀代謝中的關(guān)鍵作用，推測silymarin與羅蘇伐他汀之間存在藥物相互作用。鑒于益肝靈在臨床多年的廣泛

10、應(yīng)用，以及OATP1B1底物的廣泛性，此藥物相互作用研究具有重要的臨床意義。 基于以上研究背景，本課題旨在查明OATP1B1的遺傳多態(tài)性對于他汀藥物的攝取功能的影響，更重要的是研究此影響與藥物本身的理化特性以及藥物與轉(zhuǎn)運(yùn)體親和力的相關(guān)性。同時(shí)本課題以羅蘇伐他汀為探藥，在體外和體內(nèi)研究了益肝靈對于OATP1B1和BCRP的抑制作用。 本課題的主要研究結(jié)果如下： 一、查明了韓國健康人群OATP1B1*1a(野生型)、

11、*1b(A388G,ASh130Asp)、*5(Val174Ala)和單倍型*15(ASh130Asp/Val174Ala)多態(tài)性的分布特征，其中健康人群130Asp與174Ala突變等位基因的發(fā)生頻率分別為71.9％和15.9％，等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。 二、以健康受試者為研究對象，采用大樣本篩選出足夠的野生型和突變純合子受試者，首次從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上查明了OATP1B1*15(A388G/T521C)

12、純合子多態(tài)性對普伐他汀和匹伐他汀藥代動力學(xué)的顯著影響，由于他汀類藥物藥效學(xué)存在劑量依賴性變化，提示此藥代動力學(xué)變化將產(chǎn)生明顯的藥效學(xué)影響。 三、首次同時(shí)研究了在藥物與轉(zhuǎn)運(yùn)體的親和力以及藥物本身的理化特性不同的情況下，OATP1B1遺傳多態(tài)性對他汀藥物藥代動力學(xué)的不同影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要是與親和力相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)效能的不同導(dǎo)致了此差異。并用體外試驗(yàn)解釋并證實(shí)了臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的合理性。提示體外細(xì)胞攝取試驗(yàn)獲得的最大清除率(Vmax)和米氏常

13、數(shù)(Km)可以作為預(yù)測體內(nèi)OATP1B1單倍型導(dǎo)致做為其底物的他汀藥物藥代動力學(xué)變化程度的預(yù)測指標(biāo)。四、設(shè)計(jì)了全新的固相抽提后液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS/MS)技術(shù)，用以同時(shí)檢測血液中普伐他汀和匹伐他汀濃度，設(shè)計(jì)了匹伐他汀的固相抽提方法，與以前的方法相比較，本課題中設(shè)計(jì)的方法具有簡單，安全和高精確度的特點(diǎn)。設(shè)計(jì)了針對OATP1B1研究最多的外顯子4和外顯子5常見突變位點(diǎn)的基因分型方法，基于pyrosequencing技術(shù)，具有極其快

14、速，極高通量的顯著優(yōu)點(diǎn)。 五、在體外用cRNA顯微注射技術(shù)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞表面表達(dá)了人OATP1B1蛋白，并結(jié)合放射性同位素標(biāo)記和LC/MS/MS技術(shù)，證實(shí)了不同濃度的silymarin對羅蘇伐他汀的攝取具有明顯的濃度依賴抑制作用。同時(shí)在體外用過表達(dá)BCRP蛋白的MDCKII細(xì)胞系，結(jié)合放射性同位素標(biāo)記和LC/MS/MS技術(shù)，證實(shí)了silymarin對BCRP的底物羅蘇伐他汀的泵出有明顯濃度依賴的抑制作用。證明了在人體內(nèi)，臨床

15、劑量的silymarin對同時(shí)作為OATP1B1以及BCRPY底物的羅蘇伐他汀的藥代動力學(xué)無明顯影響，也即證實(shí)臨床治療中無需在合用此二種藥物時(shí)調(diào)節(jié)羅蘇伐他汀的劑量。由于OATP1B1和BCRP底物的廣泛性，此研究結(jié)果有廣泛意義。 綜上所述，本項(xiàng)目首次查明了韓國健康人群OATP1B1*1a、*1b、*5和由Asn130Asp與Val174Ala兩個多態(tài)性構(gòu)成的OATP1B1單倍型*15(Asn130/Val174Ala)多態(tài)性的分

16、布特征，明確了*15(Ash130Asp/Val174Ala)遺傳多態(tài)性與兩種他汀類藥物藥代動力學(xué)改變的相關(guān)性，揭示OATP1B*15突變可能增加他汀類藥物的降脂作用，并首次證明OATP1B1*15純合子對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)效能的差異與藥物-轉(zhuǎn)運(yùn)體間親和力以及藥物本身的理化特性不同有明顯相關(guān)。此外，本研究在眾多體外試驗(yàn)證據(jù)的背景下，排除了在治療劑量下，人體內(nèi)silymarin與OATP1B1以及BCRP的底物羅蘇伐他汀之間存在藥物相互作用的可能性