項目四多肽與蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)工藝

1、,生物制藥技術(shù),生物工程系,復(fù)習(xí),氨基酸類藥物生產(chǎn)的四大方法賴氨酸的提取方法胱氨酸的生產(chǎn)方法,項目四 多肽與蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)工藝,知識目標(biāo)：【明確】多肽與蛋白質(zhì)類藥物的基礎(chǔ)理論和基本知識【熟悉】多肽與蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)的基本技術(shù)和方法?！菊莆铡康湫投嚯暮偷鞍踪|(zhì)生產(chǎn)的工藝流程、生產(chǎn)技術(shù)及其操作要點相關(guān)參數(shù)的控制。能力目標(biāo)：能夠進(jìn)行典型多肽和蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)相關(guān)參數(shù)的控制、普通制藥設(shè)備的日常維護(hù)及常見故障的排除工作，并能編

2、制相應(yīng)的生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)的工藝方案。,多肽及蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)廣泛存在的生化物質(zhì)，具有多種生理功能，是非常重要的生化物質(zhì)。組成多肽和蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸，通常10--100個氨基酸分子脫水縮合而成多肽，一條或多條多肽鏈可組成蛋白質(zhì)。多肽一般沒有嚴(yán)密并相對穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)比較易變，具有可塑性，而蛋白質(zhì)分子則具有相對嚴(yán)密、比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，這也是蛋白質(zhì)發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)。多肽和蛋白質(zhì)都是氨基酸的多聚縮合物，而多肽是蛋白質(zhì)不完全水

3、解的產(chǎn)物。,項目引導(dǎo),任務(wù)一 多肽與蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)技術(shù)認(rèn)知,知識目標(biāo)： 掌握多肽類和蛋白類藥物的基礎(chǔ)知識，熟悉它們的生產(chǎn)技術(shù)。能力目標(biāo): 能夠認(rèn)識多肽類和蛋白類藥物。重點與難點： 多肽類和蛋白類藥物的生產(chǎn)技術(shù)。,,,一、多肽類藥物的基礎(chǔ)知識,1．多肽類藥物的種類 (1)多肽激素：垂體激素、下丘腦激素、甲狀腺激素、胰島激素、腸胃道激素和胸腺激素等。 (2)多肽類細(xì)胞生

4、長調(diào)節(jié)因子：表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)移因子(TF)、心鈉素(ANP)等。,（一）多肽類藥物的種類和功能特性,,(3)含有多肽成分的其他生化藥物：包括骨寧、眼生素、血活素、氨肽素、婦血寧、蜂毒、蛇毒、胚胎素、助應(yīng)素、神經(jīng)營養(yǎng)素、胎盤提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素等。,系從牛眼內(nèi)容物（水晶體、玻璃體、房水、部分視網(wǎng)膜和色素膜）中提取而得，其成分為多種氨基酸、多肽、核甙酸及微量鈣、鎂。具有增強眼的新陳代謝，促進(jìn)角膜上

5、皮組織再生,具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，周圍神經(jīng)炎及神經(jīng)痛,2．多肽類藥物的功能特性(1)作為生理活性的調(diào)節(jié)因子； (2)多肽具有非常高的生物活性，1×10-7 mol／L濃度就可發(fā)揮活性； (3)分子小，結(jié)構(gòu)易于改造，可通過化學(xué)合成的方法生產(chǎn)； (4)活性多肽的合成過程往往是由蛋白質(zhì)經(jīng)加工剪切轉(zhuǎn)化而來的。,

6、（二）多肽類藥物的藥用價值,,降鈣素,,促腎上腺皮質(zhì)素,,,,,,,加壓素,,,,二、蛋白質(zhì)類藥物的基礎(chǔ)知識,1．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的基本化學(xué)組成是20種常用的L型a--氨基酸（甘氨酸和脯氨酸除外），平均含氮量為16%，這是蛋白質(zhì)元素組成的一個特點，也是凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的理論基礎(chǔ)。 有些蛋白質(zhì)除蛋白質(zhì)部分外，還有非蛋白成分，稱為輔基或配基，這樣的蛋白質(zhì)稱為結(jié)合蛋白質(zhì)。

7、 蛋白質(zhì)是生物大分子，相對分子質(zhì)量變化范圍很大，小者數(shù)千，大者數(shù)千萬。其分子的大小已達(dá)到膠粒1--100 nm范圍之內(nèi)。,（一）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和種類,2．蛋白質(zhì)的性質(zhì)(1)物理性質(zhì)： ①沉降系數(shù) S是指每單位引力場的沉降分子下降速度。它表示分子的大小特性，其數(shù)值受分子大小和形狀的影響。 在較小的離心力作用下，大顆粒的沉降速度較快，沉降常數(shù)也大。,,,,,

8、,②摩擦系數(shù) 顆粒沉降時所受阻力與沉降速度成反比。分子越緊密，它在溶劑中的摩擦阻力就越小，沉降就越快；分子越不規(guī)則，摩擦阻力就越大，沉降就越慢。,,③擴散常數(shù) 指單位濃度梯度、單位時間和單位擴散面積下擴散的量(D)，與上述三種條件成正比。當(dāng)溫度和溶劑一定時，D值越大說明分子越小，越容易擴散。,,④溶液的黏度 在一定溶質(zhì)濃度下，溶液的黏度取決于溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量和形

9、狀。高度不對稱的分子和具有相同相對分子質(zhì)量的球形蛋白質(zhì)相比，具有較高的黏度。,,(2)化學(xué)性質(zhì) ①兩性解離與等電點 蛋白質(zhì)分子至少具有一個游離氨基和一個游離羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì)。不過因為蛋白質(zhì)所含的氨基酸種類和數(shù)目較多且有支鏈，是多價電解質(zhì)，解離情況遠(yuǎn)比氨基酸復(fù)雜。,②與茚三酮反應(yīng) 與氨基酸一樣，蛋白質(zhì)也具有茚三酮反應(yīng)，反應(yīng)原理與氨基酸反應(yīng)一樣，該反應(yīng)是

10、蛋白質(zhì)鑒定的重要依據(jù)。,,③雙縮脲反應(yīng) 蛋白質(zhì)中含有多個和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此，所有蛋白質(zhì)及二肽以上的多肽都能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)，形成紫紅色或藍(lán)紫色化合物。用此法可以鑒定蛋白質(zhì)的存在或測定其含量。,④福林-酚反應(yīng) 該方法是雙縮脲法的發(fā)展，包括兩步反應(yīng)，首先在堿性溶液中與銅作用形成銅與蛋白質(zhì)的配合物，然后這個配合物以及酪氨酸和色氨酸的殘基還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（福林試劑），產(chǎn)生深

11、藍(lán)色混合物。 ⑤紫外吸收 由于蛋白質(zhì)中存在有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，因此蛋白質(zhì)具有紫外吸收，以色氨酸吸收最強，吸收峰在280 nm波長處。,3．蛋白質(zhì)類藥物的種類(1)蛋白質(zhì)類激素 垂體蛋白質(zhì)激素：生長素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲狀腺素(TSH)、促卵泡激素(FSH)等，其中生長素有嚴(yán)格的種屬特性，動物的生長激素對人無效；

12、 促性腺激素：人絨毛膜促性腺激素(HCG)、絕經(jīng)尿促性腺激素(HMG)、血清促性腺激素(GTH)等； 其他蛋白質(zhì)激素主要包括胰島素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素等。,(2)血漿蛋白 白蛋白(Alb)、纖維蛋白溶酶原、血漿纖維結(jié)合蛋白(Fn)、免疫丙種球蛋白、抗淋巴細(xì)胞免疫球蛋白等。不同物種間的血漿蛋白存在著種屬差異，動物血不能用于人體。,(3)蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子

13、 干擾素α、β、γ，白細(xì)胞介素(l～16)(11)、神經(jīng)生長因子(NGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、組織纖溶酶原激活因子(t-PA)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。 (4)黏蛋白 主要包括胃膜素、硫酸糖肽、血型物質(zhì)A和B等。,,,,,,,,,(5)膠原蛋白

14、 主要包括明膠、氧化聚合明膠、阿膠、凍干豬皮等。 (6)堿性蛋白質(zhì) 主要包括硫酸魚精蛋白。 (7)蛋白酶抑制劑 主要包括胰蛋白酶抑制劑、大豆胰蛋白酶抑制劑等。,（二）蛋白質(zhì)的藥用價值,,,,,三、多肽和蛋白質(zhì)類藥物的生物生產(chǎn)技術(shù),來源于動物、植物及微生物，在選擇提取分離蛋白質(zhì)藥物的原料時要選擇富含所需蛋白質(zhì)多肽成分的、易于獲得和易于提取的無害生物材料。在選擇原料時應(yīng)考慮

15、發(fā)育階段、生長狀態(tài)、解剖部位、種屬等因素的影響。,（一）原料的選擇,（二）材料的預(yù)處理,對于某種待提取的多肽和蛋白質(zhì)，如果是體液中的成分或細(xì)胞外成分，則可以直接進(jìn)行提取分離；如果是細(xì)胞內(nèi)成分，就需要先將細(xì)胞破碎，使胞內(nèi)成分充分釋放到溶液中再將其提純。 常用的細(xì)胞破碎方法有機械法、物理法、化學(xué)法和酶法。,（三）多肽和蛋白質(zhì)類藥物的主要生物生產(chǎn)方法 (1)提取法 天然動植物體內(nèi)

16、的有效成分含量過低，雜質(zhì)太多，引起了人們對重組動植物的重視。 重組動植物指的是通過基因工程技術(shù)的手段，將藥物基因或能對藥物基因起調(diào)節(jié)作用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入動植物組織細(xì)胞，以提高動植物組織合成藥用成分的能力，再經(jīng)過生化分離，制得生物藥品。,(2)發(fā)酵法 微生物發(fā)酵法是多肽與蛋白質(zhì)類藥物的主要生產(chǎn)方式。 利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類藥品，具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)品質(zhì)量高的優(yōu)

17、點，一直受到全世界生物制藥企業(yè)的青睞。 多肽和蛋白質(zhì)類藥品多數(shù)屬于人體特有的細(xì)胞因子、激素、蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與動物體所含的蛋白質(zhì)存在結(jié)構(gòu)上的差異。 目前，經(jīng)過基因工程方法可生產(chǎn)絕大多數(shù)多肽和蛋白質(zhì)類藥品。,（四）多肽和蛋白質(zhì)類藥物的分離純化(1)根據(jù)等電點 多肽、蛋白質(zhì)在等電點時，其溶解度、黏度等都為最小，可利用此特性來進(jìn)行提純。(2)根據(jù)分子量大小

18、 可以用凝膠過濾法、超濾法、離心法及透析法等。(3)根據(jù)溶解度 適當(dāng)改變外界條件，可以有選擇地控制某一種蛋白質(zhì)的溶解度，達(dá)到分離的目的。如鹽析法、結(jié)晶法和低溫有機溶劑沉淀法等。,,,(4)根據(jù)離子交換能力 一般用離子交換纖維和以葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等為骨架的離子交換劑進(jìn)行分離純化。(5)根據(jù)蛋白質(zhì)功能專一性 主要通過親和層析法來進(jìn)行分離純化。(6)

19、蛋白質(zhì)易受pH、溫度、酸、堿、金屬離子、蛋白沉淀劑、配位劑等的影響，由于各種蛋白質(zhì)都存在著差異，可利用這種差異來純化蛋白質(zhì)。(7)根據(jù)蛋白質(zhì)的選擇性吸附性質(zhì)來純化蛋白質(zhì),復(fù)習(xí)回顧,1.請給下列藥物分門別類：降鈣素、干擾素、白蛋白、胸腺激素、加壓素2.蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)方法有哪些？3.你知道哪些蛋白質(zhì)類藥物的分離純化方法，請列舉兩個。,任務(wù)二 胸腺激素的分離提取、精制及質(zhì)量控制,知識目標(biāo)： 掌握胸腺激素的

20、分離提取、精制及質(zhì)量控制。能力目標(biāo): 能夠控制胸腺激素生產(chǎn)工藝要點和質(zhì)量檢測 。重點與難點： 胸腺激素生產(chǎn)工藝要點,一、生產(chǎn)前準(zhǔn)備,（一）基礎(chǔ)知識 胸腺激素制劑可以調(diào)節(jié)人體免疫功能，維持機體免疫平衡。,,胸腺激素F5應(yīng)用最廣（以小牛胸腺為原料，采用一定提取純化工藝制備的第5種成分） 胸腺激素F5是由40～50種多肽組成的混合物，這些多肽熱穩(wěn)定性好，80℃的

21、高溫不能影響其免疫活性，相對分子質(zhì)量在1000 ---15000，等電點在3.5～9.5 。,,胸腺激素用于治療細(xì)胞免疫缺損性疾病，如胸腺發(fā)育不全、重癥混合性免疫缺乏癥、運動失調(diào)性毛細(xì)血管擴張癥、麻風(fēng)、重癥感染、復(fù)發(fā)性口瘡等伴有細(xì)胞免疫功能低下的患者。亦可用于病毒性肝炎、惡性腫瘤和抗衰老。,（二）工藝路線,,,,,,若在蛋白質(zhì)溶液中加入有機溶液，如丙酮或乙醇，因 稀釋水濃度 而降低水活性，則蛋白質(zhì)上親水性區(qū)域的水合度降低，開始聚集在一起

22、，產(chǎn)生沉澱。 也可看作有機溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低。應(yīng)當(dāng)注意，有些細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，本身含有很多疏水性區(qū)，在有機溶劑中反而易溶。,,,二、生產(chǎn)工藝過程,(1)提取、過濾：生理鹽水 (2)加熱除去雜蛋白：80度加熱 (3)沉淀：-10度，丙酮,(4)鹽析：分段，硫酸銨 (5)超濾：將鹽析物溶于pH 8.0的10 mmol／L Tris（三羥甲基氨基甲烷）-HCl緩沖液中，超濾，取相對分子質(zhì)量

23、在15000以下的超濾液。 (6)脫鹽、干燥：凝膠，冷凍,Tris緩沖液用于不同pH條件下的蛋白質(zhì)晶體生長。,,,任務(wù)三 白蛋白和丙種球蛋白的分離提取、精制及質(zhì)量控制,知識目標(biāo)： 掌握白蛋白和丙種球蛋白的分離提取、精制及質(zhì)量控制。能力目標(biāo): 能夠分離提取白蛋白和丙種球蛋白。重點與難點： 白蛋白和丙種球蛋白生產(chǎn)工藝過程,一、生產(chǎn)前準(zhǔn)備,（一）基本知識

24、 白蛋白（Alb）是人血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，約占總蛋白的35%。 國內(nèi)生產(chǎn)的20G（凍干粉）/瓶人血白蛋白，統(tǒng)一最高零售價格為608元，白蛋白價格國內(nèi)生產(chǎn)的10g:50ml/瓶人血白蛋白，統(tǒng)一最高零售價格為360元,,,,分子結(jié)構(gòu)：含585個氨基酸殘基單鏈，含17個二硫鍵相對分子質(zhì)量：66500等電點：pl=4.7沉降系數(shù)：4.6溶解性：可溶于水和半飽和的硫酸銨溶液， 硫酸銨達(dá)到60%飽和

25、度時析出沉淀。穩(wěn)定性：對酸穩(wěn)定，耐熱性強于血漿中其他蛋白。高溫下可發(fā)生聚合變性。,白蛋白,白蛋白的生理作用,（1）維持血漿滲透壓的恒定 　 血漿膠體滲透壓的維持主要依靠血漿中的白蛋白，膠體滲透壓是使靜脈端組織間液重返回血管內(nèi)的主要動力。當(dāng)血漿白蛋白因病理條件引起下降時，血漿的膠體滲透壓也隨之下降，可導(dǎo)致血液中的水份過多進(jìn)入組織液而出現(xiàn)水腫。,,（2）血漿白蛋白的運輸功能 　　血漿白蛋白能與體內(nèi)許多難溶性的小分子有機物

26、和無機離子可逆地結(jié)合形成易溶性的復(fù)合物，成為這些物質(zhì)在血液循環(huán)中的運輸形式。由此可見白蛋白屬于非專一性的運輸?shù)鞍?，在生理上具有重要性，與人體的健康密切相關(guān)。,臨床意義,增高：主要由于血液濃縮而致相對性增高（嚴(yán)重的脫水和休克，大量出血、嚴(yán)重的燒傷、腎臟疾病，攝入量過高） 豆類食品 、牛奶、 瘦肉 、雞蛋、蟬俑、蜂俑減低：見于肝硬變合并腹水及其他肝功能嚴(yán)重?fù)p害（如急性肝壞死、中毒性肝炎等）營養(yǎng)不良、糖尿病、嚴(yán)重出血腎病綜合征等。

27、成人白蛋白正常值范圍為35～50g/L,人丙種球蛋白是一類主要存在于血漿中具有抗體活性的糖蛋白，也稱為免疫球蛋白 (Ig) ，約占血漿蛋白總量的20% 。 別名：普通丙種球蛋白、人血丙球、免疫血清球蛋白、丙種球蛋白 2.5g在250-300元,人丙種球蛋白,,丙種球蛋白的生理作用,,,,,１預(yù)防麻疹　 自前麻疹疫苗廣泛應(yīng)用以來已很少用丙種球蛋白。２預(yù)防甲型病毒性肝炎 在接

28、觸具有傳染性的患者后７-14 天內(nèi)注射丙種球蛋白，保護(hù)時間４-８周，對已發(fā)病者無效，也不能預(yù)防乙型肝炎。,甲型肝炎是以糞-口為主要傳播途徑，夏季，要做好疾病的防護(hù)工作，防止病從口入，安全衛(wèi)生很重要。,,３預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎　 對未接受疫苗接種而與病人有密切接觸的兒童宜盡早給予丙種球蛋白。４預(yù)防風(fēng)疹 孕婦患風(fēng)疹后胎兒可能發(fā)生先天性風(fēng)疹綜合癥（早天及多種先天性畸

29、形），故孕婦接觸風(fēng)疹后可注射丙種球蛋白有一定效果，但不能制止感染，僅使癥狀減輕。,（二）工藝路線,,,二、白蛋白及丙種球蛋白生產(chǎn)工藝過程,（一）白蛋白的生產(chǎn)工藝過程 (1)配位 用Na2CO3調(diào)pH為8.6 等體積的2%利凡諾溶液 上清液（制備丙種球蛋白用） 配合物沉淀（制備人血清白蛋白用）,乳酸依沙吖啶：中期引產(chǎn)、殺菌,,

30、,,(2)解離 沉淀用無菌蒸餾水稀釋，用0.5 mol／L稀鹽酸調(diào)至弱酸性，加0.15%～0.2%氯化鈉溶液，不斷攪拌。 (3)分離 充分解離后，解離液用錐籃式離心機分離，離心液再用不銹鋼壓濾器過濾。,,,,,(4)濃縮 超濾濃縮 (5)熱處理 辛酸鈉和乙酰色氨酸作為保護(hù)劑，在60℃恒溫處理10h，滅活病毒。

31、 辛酸鈉防止白蛋白的變性,確保制品有良好的外觀。 (6)澄清和除菌 以不銹鋼壓濾器澄清過濾，再用微濾除菌。 (7) 分裝 白蛋白含量合格后，用自動定量灌注器進(jìn)行分裝灌裝或冷凍干燥得白蛋白成品。,,,,,（二）人血丙種球蛋白的工藝過程 (1)鹽析 取上清液，調(diào)pH為7.0，加23%結(jié)晶硫酸銨，靜置4h以上使沉淀完全。 (

32、2)離心 吸取上清液，將下部混懸液泵入錐籃式離心機中離心得沉淀。 (3)過濾 將沉淀用適量無熱原的蒸餾水溶解，在不銹鋼壓濾機中進(jìn)行澄清過濾，收集濾液。,,(4)除菌 用超濾機超濾濃縮，再經(jīng)過微濾除菌，置于2-6℃環(huán)境下存放1個月以上。 (5)過濾 用不銹鋼壓濾器再一次澄清過濾，除菌。 (6) 分裝 丙種球蛋白含