原生質(zhì)體融合高效反硝化菌及其脫氮研究.pdf

1、氮素仍然是當(dāng)前地表水體水質(zhì)污染的重要源頭之一，新的脫氮處理工藝、新的填料和新的脫氮細(xì)菌等的探索和研究是生物脫氮技術(shù)的發(fā)展趨勢。隨著各種新工藝的不斷推出，工藝構(gòu)筑物內(nèi)脫氮菌群的效能成為制約新工藝推廣和使用的關(guān)鍵因素之一。生物技術(shù)的引入帶來了新的變化。本文利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，采用脫氮效能較高的原生態(tài)菌株作為原生質(zhì)體融合的親本菌株，以此建立微生物的轉(zhuǎn)化體系，來獲取更高效的脫氮菌，以期為城市污水處理的脫氮提供新的研究方向，為提高脫氮菌的脫氮效

2、率開辟新的方法。本文首先進行了原生態(tài)氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌的篩選，分別繪制生長曲線并測定其性能。接著進行了原生態(tài)組合脫氮菌的脫氮性能研究，之后進行了優(yōu)選反硝化菌的原生質(zhì)體融合及優(yōu)選融合子的脫氮性能研究，并通過性能對比和16SRDNA基因測序手段甄別了優(yōu)選融合子的親本菌，對比了原生態(tài)組合脫氮菌與優(yōu)選融合子組合脫氮菌的脫氮效能。主要結(jié)論有：
　　 ⑴通過專用培養(yǎng)基，采用極限稀釋法和平板劃線法，篩選獲得三株較高效的反硝化菌FX1,

3、FX2和FX3，經(jīng)鑒定，菌株FX1和FX3 為芽孢桿菌屬，F(xiàn)X2 為沙雷氏菌屬。繪制反硝化菌FX1,FX2和FX3的生長曲線，進行脫氮性能對比實驗。結(jié)果表明，菌株FX1,FX2和FX3 均有脫氮功能，菌株的四個生長周期較為明顯，0-4h 為其延緩期，4-16h 為對數(shù)期，TIN 去除率明顯增大，16-20h后為穩(wěn)定期，TIN 去除率仍有所增長，但增速減緩，20h后為衰亡期，對TIN的去除效果明顯減弱，直至穩(wěn)定。三株菌株中，F(xiàn)X2 為反硝

4、化效果最優(yōu)，F(xiàn)X1 次之，F(xiàn)X3 菌株最差；單因素實驗結(jié)果顯示，在溫度低于30℃時，其脫氮率隨溫度升高而增大，但當(dāng)溫度高于30℃后，其脫氮率呈隨溫度升高下降的趨勢；正交實驗表明：影響反硝化菌株FX1的脫氮效率的因素的主次順序依次為：培養(yǎng)時間>>溫度>>Ph 值； 影響菌株FX2的脫氮效率的因素的主次順序依次為：溫度>>培養(yǎng)時間>>Ph 值。反硝化菌株FX1 各因素中最佳的反硝化條件為：培養(yǎng)時間為14 h，溫度35℃，Ph 為7.5；反硝

5、化菌株FX2的最佳反硝化條件為：培養(yǎng)時間為16 h，溫度25℃，Ph 為7.0。
　　 ⑵根據(jù)顯色反應(yīng)，確定氨氧化富集培養(yǎng)基I 作為實驗用氨氧化菌富集培養(yǎng)基，分離、純化得到1 株氨氧化菌A1。繪制其生長曲線，表明其生長周期較長，前3天生長非常緩慢，NH3-N的去除率也相應(yīng)較低，第4-7天是氨氧化速率明顯提高；在確定硝化菌富集培養(yǎng)基Ⅰ為較優(yōu)硝化菌培養(yǎng)基后，分離、純化得到3 株硝化菌X1、X2和X3。選定硝化菌X2 進行最優(yōu)硝化條件

6、的L9(34)正交實驗。結(jié)果表明，影響硝化菌X2 平均日硝化速率的因素的主次順序依次為：培養(yǎng)時間>>溫度>>Ph；硝化菌X2的最佳硝化條件為：溫度30℃，Ph 值為7.0，培養(yǎng)時間為6d。
　　 ⑶配制模擬污水，進行原生態(tài)組合脫氮菌的脫氮實驗。測得配置后的模擬生活污水主要水質(zhì)指標(biāo)為：COD=300-350mg/L，TP=6.9-9.2mg/L，NH3-N=16.2-20.5mg/L。以總氮去除率計時，只有氨氧化菌或硝化菌時，總氮

7、去除率很低，當(dāng)氨氧化菌和硝化菌組合時，總氮去除率略有提高，表現(xiàn)出復(fù)配效應(yīng)，但效能仍然較低。當(dāng)氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌組合時，總氮去除率有較為明顯的提高，均高于90％，且組合Ⅰ的總氮去除率較優(yōu)于組合Ⅱ。菌種組合過程中，表現(xiàn)出明顯的群體效應(yīng)。
　　 ⑷優(yōu)選脫氮菌的原生質(zhì)體融合實驗及融合子組合脫氮菌的脫氮實驗。將優(yōu)選得到的氨氧化菌A1、硝化菌X2以及反硝化菌FX1、FX2 進行了紫外誘變和抗藥性篩選。在紫外誘變過程中，F(xiàn)X1和FX2

8、 對紫外線的耐受能力較強，A1 菌株次之，而X2 菌株對紫外線照射最為敏感。為了保證致死效果，F(xiàn)X1 菌株和FX2 菌株照射80s，得到突變菌株FXB1和FXB2?？顾幮院Y選過程中，采用青霉素G 鈉鹽和鏈霉素作為抗藥性標(biāo)記，在選擇壓為40μg/Ml 時進行了抗藥性正突變菌株的篩選，將有單重抗藥性的突變菌株進行了5次傳代培養(yǎng)，選擇具有穩(wěn)定遺傳性的正突變菌株作為原生質(zhì)體融合的親本菌株。原生質(zhì)體制備過程中，所采用的溶菌酶濃度為400μg/Ml

9、，酶解溫度為30℃，酶解時間為10-16h。原生質(zhì)體融合過程中，采用平均分子量為6000，質(zhì)量濃度為40％的PEG 促融。實驗中采用的促融時間為6min，促融架橋的Ca2+濃度為0.015mol/L。在經(jīng)過6 代傳代培養(yǎng)后，經(jīng)雙抗平板篩選，得到R1、R2、R3、R4、R5等5種融合子。
　　 ⑸將挑選出的融合子R1、R2、R3、R4、R5和親本菌株A1、X2和FX1、FX2（作為對照）按10％的接種量接入250mL的模擬污水（將

10、富集培養(yǎng)基稀釋5倍）中進行脫氮實驗，篩選出融合子R2 為反硝化效果得到明顯提高的反硝化菌融合子。通過16S RDNA基因的PCR擴增及序列分析，進行DNA含量對比，判斷融合子R2的親本菌株是反硝化菌FX2。
　　 ⑹繪制融合子R2的生長曲線。結(jié)果表明，通過融合之后，融合子的生長量有一定增加。利用模擬污水測定了其脫氮性能，在0-4h 階段優(yōu)選融合子R2與親本菌FX2的反硝化效能比較接近，但在4-8h 時，兩種菌的反硝化效能開始明顯

11、變化，融合子R2的總氮去除率優(yōu)于親本菌FX2，這種優(yōu)勢一直持續(xù)到22h，最大差別為27.58％（16h 時）。說明通過原生質(zhì)體融合技術(shù)，可使優(yōu)選反硝化菌的脫氮效能得到27％左右的提高。
　　 ⑺進行了原生態(tài)組合脫氮菌和優(yōu)選融合子組合脫氮菌的脫氮實驗。將原生態(tài)組合脫氮菌中的優(yōu)勢組合A1+X2+FX1與優(yōu)選融合子組合脫氮菌A1+X2+R2 進行脫氮效能對比實驗，結(jié)果顯示，優(yōu)選融合子組合脫氮菌的脫氮效能一直略優(yōu)于原生態(tài)組合脫氮菌，特別