高通量篩選環(huán)境雌激素類化合物的方法學研究.pdf

1、環(huán)境內分泌干擾物是指由于人類的生產和生活活動釋放到環(huán)境中的、對人體內和動物體內內源性的正常激素功能施加影響，從而影響機體內分泌系統(tǒng)化學物質作用的物質，這類物質通稱為“外源性干擾內分泌的化學物質”。環(huán)境雌激素是環(huán)境內分泌干擾物中最大的一類，也是研究最多，最受重視的一類。目前，檢測環(huán)境雌激素的方法主要有化學法和生物法?；瘜W法檢測環(huán)境雌激素靈敏度高、特異度好，定性和定量準確。但是用儀器檢測環(huán)境雌激素，只能對已知的環(huán)境雌激素進行檢測，而且，在檢

2、測前一般還要對樣品要進行提取、凈化、濃縮等前期處理。由于這些化學方法使用的儀器昂貴、檢測成本高、分析過程冗長、技術復雜、對檢測人員專業(yè)化程度要求高，不適合大量樣本的環(huán)境雌激素常規(guī)檢測。建立在生物學基礎上檢測環(huán)境雌激素的方法大多需要進行細胞培養(yǎng)，對實驗室條件要求較高、費時費力，不同的實驗室使用的細胞不同，不便于結果的相互比較，培養(yǎng)細胞所用的血清也要經過活性炭和葡聚糖處理，去除血清中內源性的雌激素后才能使用，否則會出現(xiàn)假陽性的結果。有的環(huán)境

3、雌激素還具有細胞毒性，這樣有可能導致得出錯誤的結論。
　　 因此，根據(jù)大多數(shù)環(huán)境雌激素與機體作用都是干擾天然雌激素與雌激素受體結合，我們以雌激素受體競爭結合分析為基礎，建立以下三種方法來高通量的篩選環(huán)境雌激素。
　　 第一部分：基于ELISA的受體競爭結合法檢測環(huán)境雌激素
　　 目的：環(huán)境雌激素是最主要的一類環(huán)境內分泌干擾物，它們進入生物體后，可通過干擾生物體自身激素的合成、分泌、轉運、結合、活性反應、代謝、消解

4、或產生類似生物體自身激素的作用，對生物有機體維護正常的動態(tài)平衡、繁殖、生長及行為產生不利的影響。本研究的目的旨在建立環(huán)境雌激素的體外快速篩選方法。
　　 方法：采用免疫測定介導受體競爭結合試驗定量檢測環(huán)境雌激素。將17β-雌二醇-BSA固定在微孔板上，環(huán)境雌激素與微孔板上的17β-雌二醇-BSA競爭性的與雌激素受體結合，與微孔板上17β-雌二醇-BSA結合的受體與雌激素受體的抗體、雌激素受體抗體的二抗形成一個三明治形式的復合物，

5、通過顯色劑顯色，最后用比色法對試驗結果進行定量。
　　 結果：整個反應中環(huán)境雌激素濃度越高，溶液的吸光度值的變化就越小，環(huán)境雌激素的濃度與吸光度值成負相關。定量研究可以得到環(huán)境雌激素劑量－效應關系曲線，在一定濃度范圍內（10ng/L～100μg/L），溶液的吸光度值與環(huán)境雌激素的濃度直接呈現(xiàn)良好的線形關系（R2=0.9583）。利用這種方法能檢測到的標準品雌二醇的最低濃度為10ng/L。
　　 結論：本方法檢測環(huán)境雌激素

6、操作簡便、無需復雜昂貴的儀器，具有廣泛的應用前景。
　　 第二部分：熒光標記17β-雌二醇檢測環(huán)境雌激素
　　 目的：熒光標記這種非放射性標記技術已成為現(xiàn)代分析檢測中不可或缺的重要方法之一,然而將此技術應用于環(huán)境雌激素的篩選并不廣泛。本研究旨在探索熒光標記技術在環(huán)境雌激素定量檢測中的應用。
　　 方法：首先將雌激素受體的抗體固定于微孔板中，將待測樣本或17β-雌二醇、與定量的17β-雌二醇-FITC、雌激素受體混

7、和后加入微孔板中，孵育后取上清（上清中含有因環(huán)境雌激素干擾而未能與雌激素受體結合的的17β-雌二醇-FITC），加入另一新的微孔板中，用酶標儀檢測溶液中熒光信號的強度。
　　 結果：溶液的熒光強度與環(huán)境雌激素的濃度呈正相關，在一定濃度范圍內（10ng/L～100μg/L），溶液的熒光強度與環(huán)境雌激素濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系（R2=0.9793）。利用這種方法能夠檢測到的標準品17β-雌二醇的最低濃度為10 ng/L。
　

8、　 結論：本研究方法檢測環(huán)境雌激素靈敏度高，無需復雜昂貴的設備，試驗操作非常簡單，可在微孔板和芯片上進行，是一種高通量快速篩選環(huán)境雌激素的方法。
　　 第三部分：納米金顆粒修飾雌激素受體反應原件檢測痕量環(huán)境雌激素的方法學研究
　　 目的：雌激素受體競爭結合分析試驗是重要的環(huán)境雌激素的篩選試驗，是美國EDSTAC首選的第一級環(huán)境內分泌干擾物篩選試驗之一。本研究根據(jù)環(huán)境雌激素在機體內發(fā)揮作用的基本機理，即環(huán)境雌激素進入機體

9、，結合并激活雌激素受體，進而使受雌激素受體控制的基因表達。本研究是利用納米金標記檢測技術介導雌激素受體競爭結合分析建立的一種環(huán)境雌激素高通量快速篩選方法。
　　 方法：首先將17β-雌二醇-BSA固定于微孔板中，將待測樣本與定量的雌激素受體混和后加入微孔板中，孵育后取上清（上清中含有因環(huán)境雌激素干擾而未能與微孔板上的17β-雌二醇結合的雌激素受體），將上清加入另一包被有雌激素受體抗體的的微孔板中，使雌激素受體與抗體結合，然后加入

10、標記有納米金的雌激素反應元件探針，孵育一段時間，用銀染增強顯色檢測光密度。
　　 結果：在一定的反應時間內，溶液的吸光度值與環(huán)境雌激素的量呈正相關，定量研究可以得到在一定反應時間點（銀染增強時間100～140秒）和一定濃度范圍內（100pg/L～1μg/L），溶液的吸光度值與17β-雌二醇之間呈現(xiàn)良好的線性關系（R2=0.9764）。利用這種方法能夠檢測到的標準品17β-雌二醇的最低濃度為100 pg/L。
　　 結論：