薄層層析、柱層析

1、色譜法（層析法）,一、實驗目的,1、了解色譜法分離、提純有機化合物的基本原理和應用。2、掌握柱層析、薄層層析的操作技術。,二、實驗原理,色譜法（Chromatography）亦稱色層法、層析法等。 色譜法是分離、純化和鑒定有機化合物的重要方法之一。色譜法的基本原理是利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其親和性的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)進行反復的吸附或分配作用，從而使各組分分離。,色譜法須在兩相系

2、統(tǒng)間進行。一相是固定相，需支持物，是固體或液體。另一相為流動相，是液體或氣體。當流動相流經(jīng)固定相時，被分離物質(zhì)在兩相間的分配，由平衡狀態(tài)到失去平衡到又恢復平衡，即不斷經(jīng)歷吸附和解吸的過程。隨著流動相不斷向前流動，被分離物質(zhì)間出現(xiàn)向前移動的速率差異，由開始的單一區(qū)帶逐漸分離出許多區(qū)帶，這個過程叫展層。,分類,按層析的機理劃分： 吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等?！　∥綄游觯豪梦絼┍砻鎸?/p>

3、不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。　　分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離?！　‰x子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同?！　∧z層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。,按流動相與固定相的不同劃分： 氣相色譜（層析）、液相色譜（層析）。 這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。 如同時區(qū)分流動

4、相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。,按操作形式劃分： 　　 柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。 紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。 薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定?！　?以上劃分無嚴格界限，有些名稱相互交

5、叉，如親和層析應屬于一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析。,吸附色譜主要是以氧化鋁、硅膠等為吸附劑，將一些物質(zhì)自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶劑洗脫或展開，利用不同化合物受到吸附劑的不同吸附作用，和它們在溶劑中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附劑上和溶液之間分布情況的不同而得到分離。吸附色譜分離可采用柱色譜和薄層色譜兩種方式。,（一）柱層析法,1.原理,流動相流過時各組分會以不同的速率向下移動，吸附弱的組

6、分以較快的速率向下移動。隨著流動相的移動，在新接觸的固定相表面上又依這種吸附-溶解過程進行新的分配，新鮮流動相流過已趨平衡的固定相表面時也重復這一過程，結(jié)果是吸附弱的組分隨著流動相移動在前面，吸附強的組分移動在后面，吸附特別強的組分甚至會不隨流動相移動，各種化合物在色譜柱中形成帶狀分布，實現(xiàn)混合物的分離。,2.柱色譜分離條件⑴ 固定相選擇    柱色譜使用的固定相材料又稱吸附劑。

7、 吸附劑對有機物的吸附作用有多種形式。以氧化鋁作為固定相時，非極性或弱極性有機物只有范德華力與固定相作用，吸附較弱；極性有機物同固定相之間可能有偶極力或氫鍵作用，有時還有成鹽作用。這些作用的強度依次為： 　　成鹽作用 > 配位作用 > 氫鍵作用 > 偶極作用 > 范德華力作用。 有機物的極性越強，在氧化鋁上的吸附越強。,表1：各種吸附劑對于極性有機物的吸附作用強度,常用吸附劑有氧化鋁、硅膠、活性炭等（

8、表1）。,纖維素、淀粉硅酸鎂硫酸鈣硅膠弗羅里硅土氧化鎂中性氧化鋁活性炭,,對極性有機物的吸附作用增強,色譜用的氧化鋁可分酸性、中性和堿性三種。酸性氧化鋁pH約為4-4.5，用于分離羧酸、氨基酸等酸性物質(zhì)；中性氧化鋁pH值為7.5，用于分離中性物質(zhì)，應用最廣；堿性氧化鋁pH為9-10，用于分離生物堿、胺和其它堿性化合物等。吸附劑的活性與其含水量有關。含水量越低，活性越高。脫水的中性氧化鋁稱為活性氧化鋁。硅膠是中性的吸附劑

9、，可用于分離各種有機物，是應用最為廣泛的固定相材料之一?；钚蕴砍Ｓ糜诜蛛x極性較弱或非極性有機物。吸附劑的粒度越小，比表面越大，分離效果越明顯，但流動相流過越慢，有時會產(chǎn)生分離帶的再重疊，適得其反。,⑵ 流動相選擇    色譜分離使用的流動相又稱展開劑 。     展開劑對于選定了固定相的色譜分離有重要的影響。,在色譜分離過程中混合物中各組分在吸附劑和

10、展開劑之間發(fā)生吸附-溶解分配，強極性展開劑對極性大的有機物溶解的多，弱極性或非極性展開劑對極性小的有機物溶解的多，隨展開劑的流過不同極性的有機物以不同的次序形成分離帶。在氧化鋁柱中，選擇適當極性的展開劑能使各種有機物按先弱后強的極性順序形成分離帶，流出色譜柱。,表2：各種展開劑對極性有機物的溶解能力,石油醚環(huán)己烷四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮吡啶乙醇甲醇水乙酸,,對極性有機物的溶解作用增強,當一種溶劑不能實現(xiàn)很

11、好的分離時，選擇使用不同極性的溶劑分級洗脫。 如一種溶劑作為展開劑只洗脫了混合物中一種化合物，對其它組分不能展開洗脫，需換一種極性更大的溶劑進行第二次洗脫。這樣分次用不同的展開劑可以將各組分分離。,薄層層析又叫薄板色譜，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實驗技術，屬固-液吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時，把吸附層加厚加大，又可用來精制樣品，

12、此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，薄層色譜法還可用來跟蹤有機反應及進行柱色譜之前的一種“預試”。,（二）薄層層析法,1.原理： 吸附劑被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂層。干燥后在涂層的一端點樣，放入一個盛有少量展開劑的的有蓋容器中。展開劑接觸到吸附劑涂層，借毛細作用向上移動。經(jīng)過在吸附劑和展開劑之間的多次吸附-溶解作用，將混合物中各組分分離成孤立的樣點，實現(xiàn)混合物的分離。

13、,2.色譜條件,⑴固定相選擇     柱色譜中提到的吸附劑都可以用作為薄層色譜的固定相，分離性能及使用選擇同柱色譜的選擇原則相同（各種吸附劑見柱色譜表1）。    一般用于薄層色譜時，要求吸附劑的粒度更小。商品吸附劑區(qū)分為色譜級（用于柱色譜）和薄層色譜級（用于薄層色譜）。,⑵展開劑選擇    薄層色譜展開劑的選

14、擇和柱色譜一樣，主要根據(jù)樣品中各組分的極性、溶劑對于樣品中各組分溶解度等因素來考慮。展開劑的極性越大，對化合物的洗脫力也越大。（各種溶劑極性見柱色譜表2）。,選擇展開劑時，除參照表列溶劑極性來選擇外，更多地采用試驗的方法，在一塊薄層板上進行試驗： ①若所選展開劑使混合物中所有的組分點都移到了溶劑前沿，此溶劑的極性過強； ②若所選展開劑幾乎不能使混合物中的組分點移動，留在了原點上，此溶劑的極性過弱。  

15、  當一種溶劑不能很好地展開各組分時，常選擇用混合溶劑作為展開劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次試驗，直到選出合適的展開劑組合。合適的混合展開劑常需多次仔細選擇才能確定。,⑶相對移動值 從點樣原點開始到展開后的溶劑前沿，是溶劑的移動距離，記為l0，混合物中各組分的移動距離分別記為l1，l2，l3 …（移動值示意圖）。,比移值示意圖,在不同的展開條

16、件下，各化合物的移動距離不會相同，而在同一條件下，相對于展開劑的移動距離，各化合物有可比較的展開數(shù)據(jù)，稱為相對移動值，或比移值： Rf=l1/l0在相同條件下測得的比移值可以作為化合物的薄層色譜特征值進行比較對照。,l0,l1,l2,⑷顯色     分離的化合物若有顏色，很容易識別出來各個樣點。但多數(shù)情況下化合物沒有顏色，要識別樣點，必須使樣點顯色。通用的顯色方法有碘蒸氣顯色和紫外線顯色。&

17、#160;   ①碘蒸氣顯色：將展開的薄層板揮發(fā)干展開劑后，放在盛有碘晶體的封閉容器中，升華產(chǎn)生的碘蒸氣能與有機物分子形成有色的締合物，完成顯色。    ②紫外線顯色：用摻有熒光劑的固定相材料（如硅膠F，氧化鋁F等）制板，展開后在用紫外線照射展開的干燥薄層板，板上的有機物會吸收紫外線，在板上出現(xiàn)相應的色點，可以被觀察到。   

18、0;有時對于特殊有機物使用專用的顯色劑顯色。此時常用盛有顯色劑溶液的噴霧器噴板顯色。,3.薄層色譜應用,⑴可用于判斷兩個化合物是否相同（同一展開條件下是否有相同的移動值）； ⑵可用于確定混合物中含有的組分數(shù)；⑶可用于為柱色譜選擇合適的展開劑，監(jiān)視柱色譜分離狀況和效果；⑷可用于檢測反應過程。,三、基本操作,正確裝柱、制板、點樣及分離操作,,,薄層板在不同的層析缸中展開的方式,1、裝柱用鑷子取少許脫脂棉放于干凈的色譜柱底部

19、，輕輕塞緊，關閉活塞，通過一干燥的玻璃漏斗向柱中慢慢加入色譜柱用中性氧化鋁10g，并用橡皮塞輕輕敲打色譜柱下部，使填裝緊密，在上面加一片小圓濾紙或脫脂棉使表面水平。用滴管沿管壁加入酒精，使酒精順柱體向下展開，打開活塞，控制流出速度為1滴/秒。,【柱色譜操作步驟】,2、進樣 待酒精全部浸潤氧化鋁，液面剛好流至濾紙面時，立即用滴管從層析柱管中心加入待分離樣品溶液，當此溶液流至接近濾紙面時，立即用少量溶劑洗下管壁的有色物質(zhì)

20、，如此連續(xù)2—3次，直至洗凈為止。3、洗脫 依次用酒精和NaOH洗脫，控制流出速度。整個過程都應有洗脫劑覆蓋吸附劑。（每一種試劑加入前，前一種都要剛剛浸過濾紙片）,【薄層色譜操作步驟】,1、薄層板的制備（濕板的制備） 薄層板制備的好壞直接影響色譜的結(jié)果。薄層應盡量均勻且厚度要固定。否則，在展開時前沿不齊，色譜結(jié)果也不易重復。在燒杯中放入2g硅膠，加入5—6ml蒸餾水，調(diào)成糊狀。將配制好的漿料傾注到

21、清潔干燥的載玻片上，拿在手中輕輕的左右搖晃，使其表面均勻平滑，在室溫下晾干后進行活化。也可買市售的硅膠板切割成適宜大小備用。本實驗用此法制備薄層板：吸附劑為硅膠G，用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液調(diào)成漿料。,2、點樣 先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用毛細管吸取樣品，在起始線上小心點樣，吹干。斑點直徑一般不超過2mm。若因樣品溶液太稀，可重復點樣，但應待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點樣，以防

22、樣點過大，造成拖尾、擴散等現(xiàn)象，而影響分離效果。若在同一板上點幾個樣，樣點間距離應為0.5-1cm，且不能離邊沿太近。點樣要輕，不可刺破薄層。 當展開劑到達距離另一端0.5cm處時拿出薄板，用鉛筆將最遠處做好記號，吹干樣品點，測量l1、l0，計算Rf,3、展開 薄層色譜的展開，需要在密閉容器中進行。在層析缸中加入配好的展開溶劑，使其高度不超過1cm。將點好的薄層板小心放入層析缸中，點樣一端朝下（點樣面朝上），浸

23、入展開劑中。蓋好瓶蓋，觀察展開劑前沿上升到一定高度時取出，盡快在板上標上展開劑前沿位置。吹干，觀察斑點位置，計算Rf值。,四、實驗關鍵及注意事項：,1、薄層層析時，薄層板的制備要厚薄均勻，表面平整光潔。2、點樣時，各樣點間距1—1.5cm，樣點直徑應不超過2mm，不能太靠邊。3、柱層析時，柱子要致密緊實，無氣泡。洗柱、分離時洗脫劑液面不能低于柱中填充物上面。,吸附劑的吸附力強弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來決定

24、。被吸附物的化學結(jié)構(gòu)如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。 常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最強。 吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數(shù)吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用于能溶于有機溶劑的有機化合物的分離，較少用于無機化合物。 洗脫溶劑的解析能力的強弱順序是：醋酸、水、甲醇、

25、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數(shù)種不同強度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統(tǒng)，以獲得最佳分離效果。,,吸附層析,在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等，這些親水物質(zhì)能儲留相當量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區(qū)帶。,,分配層析,離子交換層析,支持物是人工交聯(lián)的帶

26、有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。 帶陽離子基團的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。 離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物，包括有機物和無機物。對于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物

27、的離子，各種物質(zhì)在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數(shù)，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區(qū)帶。,,支持物是人工合成的交聯(lián)高聚物，在水中膨脹后成為凝膠。凝膠內(nèi)為內(nèi)水層，凝膠周圍的水為外水層?？刂平宦?lián)度以形成不同孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠只允許被分離物質(zhì)中小于孔徑的分子進入，大于孔徑的分子被排斥在外水層，最