利用固定化酵母進(jìn)行黃酒主發(fā)酵的初步研究

1、2012V0131NO1162SerialNo238ChinaBrewingInnovati。nandKn。wledgeTransfer利用固定化酵母進(jìn)行黃酒主發(fā)酵的初步研究譚檑華1，周建弟2，劉楊露，蔣予箭件(1浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310012；2中國(guó)紹興黃酒集團(tuán)有限公司，浙江紹興312000)摘要：該文以海藻酸鈣凝膠為固定化載體，從酵母濃度、海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度3方面來(lái)探究黃酒主發(fā)酵階段的最佳固定化條件，確定

2、了酵母濃度為109個(gè)／mL，海藻酸鈉濃度為2O％，氯化鈣濃度為4％。同時(shí)將其與傳統(tǒng)游離酵母的發(fā)酵曲線進(jìn)行對(duì)比，并且在實(shí)驗(yàn)室條件下連續(xù)進(jìn)行了12次固定化酵母發(fā)酵，結(jié)果顯示豐發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒樣的酒精度在74％vol左右(與游離發(fā)酵結(jié)果類(lèi)似)，穩(wěn)定性較為理想。關(guān)鍵詞：黃酒；固定化酵母；游離酵母；酒精發(fā)酵中圖分類(lèi)號(hào)：TS2624文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0254—5071(2012)01—0162—04StudyOnricewineprimaryfe

3、rmentationwithimmobilizedyeastTANLeihualZHOUJiandi2LIUYanglulJIANGYujianl(1ZhejiangGongshangUniversityHangzhou31001ZChina；2ChinaShaoxingRiceWineGroupCo，Ltd，Shaoxin9312000china)Abstract：Thericewineprimaryfermentationwaspe

4、rformedusingimmobilizedyeastcellsbysodiumalginateandcalciumchlorideTheoptimumimmobilizationconditionswereasfollows：thedensityofimmobilizedyeastcellwas109cfu／m1theconcentrationofsodiumalginateandcalciumchloridewere2O％and4

5、％，respectivelyThegrowthcurvesofimmobilizedyeastandfreeyeastwerecomparedInaddition，continuousprimaryfermentationofricewinewithimmobilizedyeastwasperformedfor12timesTheresultsindicatedthatalcoholdegreeofricewinewasaround74

6、％vol，whichwassimilartothatofproductfermentedbyfreeyeast，andthestabilitywasidealKeywords：riceWine：immobilizedyeaS；freeyeast；alcoholicfermentmion固定化技術(shù)是利用物理或者化學(xué)方法，將游離的微生物細(xì)胞或酶定位于設(shè)定的空間區(qū)域并維持其原有活性，使之成為連續(xù)流動(dòng)的生物反應(yīng)器且可反復(fù)使用的一種生物技術(shù)。目前

7、，這項(xiàng)技術(shù)在啤酒、葡萄酒、果酒等領(lǐng)域的文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)較為多見(jiàn)，但是應(yīng)用于黃酒生產(chǎn)的研究資料則相對(duì)較少I(mǎi)。8】。與傳統(tǒng)的游離發(fā)酵相比，固定化技術(shù)有諸多優(yōu)點(diǎn)：高細(xì)胞密度、高發(fā)酵速率、產(chǎn)物與細(xì)胞易分離、固定化酵母重復(fù)利用率高且有望實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)等f(wàn)9】。本實(shí)驗(yàn)所采用的是海藻酸鈣包埋法，從固定化酵母濃度(106個(gè)／mL、107個(gè)／mL、108個(gè)／mL、109個(gè)／mL、1010個(gè)／mL)、海藻酸鈉濃度(10％、15％、20％、25％、30％)、氯化

8、鈣濃度(1％、2％、3％、4％、5％)3個(gè)方面探討了該技術(shù)在黃酒主發(fā)酵階段的最佳固定化條件，并且比較了游離發(fā)酵和連續(xù)3次固定化發(fā)酵之問(wèn)各項(xiàng)理化指標(biāo)的差異，以及在實(shí)驗(yàn)室條件下連續(xù)進(jìn)行了12次固定化發(fā)酵，結(jié)果顯示酒樣的穩(wěn)定性較為理想，為黃酒行業(yè)中利用固定化技術(shù)改進(jìn)生產(chǎn)作了一些探索。1材料與方法11材料菌種：黃酒專(zhuān)用釀酒活性干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司)。大米：市售糯米。試劑：液化酶(江蘇博立生物制品有限公司)。糖化酶(江蘇博立生物制品有

9、限公司)。海藻酸鈉、氯化鈣、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、硫酸銅、次甲基藍(lán)、甲基紅、甲醛、乳化硅油消泡劑。儀器：pHS3C型酸度計(jì)、電子天平、水浴鍋、離心機(jī)、E100尼康生物顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、滅菌鍋、手持折光儀、注射器等。12方法121糖化液的制備將10009磨好的糯米粉跟1000mL水混合并攪拌均勻，在沸水浴中加熱片刻后加入lmL液化酶，液化1h。然后加入已活化的糖化酶(259糖化酶加到30mL蒸餾水中，38％水浴

10、活化30min)，攪拌均勻后在60％水浴中糖化2h，糖化結(jié)束后離心。上清液經(jīng)12l℃滅菌15min后冷卻，置于冰箱保存，發(fā)酵前用手持折光儀調(diào)整糖度到20。Brix。糯譽(yù)粉l_沸水浴液化。60℃水浴糖化離心、滅菌刀、J122固定化酵母的制備及發(fā)酵酵母活化：159安琪干酵母加到200mL、2％的葡萄糖溶液中，38℃活化1h。菌體計(jì)數(shù)：活化菌液在4000r／min下離心15min，棄去上清液得酵母泥。取19酵母泥加入到9mL蒸餾水中，梯度稀釋

11、法進(jìn)行稀釋?zhuān)蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并記錄每克酵母泥中含有的酵母數(shù)(酵母數(shù)量級(jí)基本保持在101仉個(gè)／克酵母泥)。收稿日期：20110930基金項(xiàng)目：浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009C21017)作者簡(jiǎn)介：譚檑華(1988)，女，在讀碩士研究牛。研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程；蔣予箭，教授，通訊作者。萬(wàn)方數(shù)據(jù)2012V0131No1164SerialNo238ChinaBrewingInnovati。nandKn。wledgeTransfer過(guò)高時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度

12、過(guò)大則會(huì)一定程度上影響物質(zhì)的傳輸，進(jìn)而影響酵母酒精發(fā)酵的正常進(jìn)行。所以綜合考慮，氯化鈣濃度選4％較為理想。／／／／i12345氯化鈣濃度／％圖3氯化鈣濃度對(duì)酒精度的影響Figure3Effectofconcentrationofcalciumchlorideonalcoholcontent實(shí)驗(yàn)以海藻酸鈉一氯化鈣作為酵母細(xì)胞的固定化材料，當(dāng)海藻酸鈉濃度20％，氯化鈣濃度4％時(shí)，固定化酵母能很好地完成黃酒主發(fā)酵過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)

13、道的結(jié)論，即最適海藻酸鈉濃度為15％～30％，氯化鈣濃度為2％～6％，基本一致【141。23固定化酵母與游離酵母的發(fā)酵過(guò)程比較將游離酵母和連續(xù)3次固定化酵母發(fā)酵過(guò)程中的各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如下。368364360356g352古348344340336332一游離酵f江一周定酵母(‘酵)—一】劃定酵母(：酵)—一Ⅲ定酵雌(二酵)l2345發(fā)酵天數(shù)／d圖4主發(fā)酵過(guò)程pH值的變化Figure4ChangeofpHvalueinprim

14、aryfermentationprocessJ●竺＼捌缸醯翻一游離酵母el占I定酵蹲(‘酵)—一【叫定酵蹲(：酵)—一【叫定酵母(二酵)12345發(fā)酵人數(shù)／d圖5主發(fā)酵過(guò)程總酸含量的變化Figure5Changeoftotalacidinprimaryfermentationprocess最初階段，微生物快速生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)使得pH值下降，但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒精含量的上升在一定程度上抑制了有害微生物的侵入生長(zhǎng)和酵母本身的產(chǎn)

15、酸，同時(shí)堿性物質(zhì)(堿性氨基酸、核苷酸、高級(jí)醇等)含量增多，pH值又有所上升。3批次固定化細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程的pH變化曲線與游離酵母細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程的pH曲線十分相似，最終發(fā)酵液的pH值在33～35之間波動(dòng)，差別不大。從圖5可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，不管是傳統(tǒng)的游離發(fā)酵還是固定化酵母發(fā)酵，總酸含量的總體趨勢(shì)都是先快速上升，然后趨于平穩(wěn)。但是觀察發(fā)酵第一天的總酸數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，連續(xù)3次固定化酵母總酸含量(依次為1629／L、1939／L、1899／L)都明

16、顯低于游離酵母總酸含量(2549／L)，這表明黃酒酵母細(xì)胞被固定化后，酸類(lèi)物質(zhì)的代謝過(guò)程有一定的遲滯效應(yīng)，所以出現(xiàn)固定化樣液中的總酸含量明顯低于傳統(tǒng)發(fā)酵液的現(xiàn)象。然而主發(fā)酵結(jié)束后，酒樣中的總酸值差異不大，基本上在309／L附近小幅波動(dòng)，說(shuō)明對(duì)于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程而言，酵母的代謝并沒(méi)有因?yàn)楣潭ɑ夹g(shù)而受到太大的影響。黃酒主發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)堑淖兓鐖D6所示，不管是傳統(tǒng)發(fā)酵還是固定化發(fā)酵，總體上都是呈現(xiàn)不斷下降趨勢(shì)，但是游離酵母最開(kāi)始的降糖速度要快于

17、固定化酵母，后隨著發(fā)酵的進(jìn)行兩者殘?zhí)呛恐饾u接近。f一●3＼蚓赴糞鼴一游離酵母一【爿定酵母(‘酵)—一閻定酵母(：酵)—一圊定酵母(二酵)l2345發(fā)酵天數(shù)／d圖6主發(fā)酵過(guò)程殘?zhí)呛康淖兓疐igure6Changeofresidualsugarcontentinpdmaryfermentationprocess一游離酵母el占J定酵母(’酵)一I甸定酵母(二酵)—一固定酵母(三酵)l2345發(fā)酵天數(shù)／d圖7主發(fā)酵過(guò)程酒精度的變化Figu