云泛素化酶USP26基因的2個無義突變及6個借義突變對其酶活性的影響.pdf

1、目的:泛素特異性蛋白酶基因Usp26位于Xq26.2，其mRNA含2794個堿基對，可編碼913個氨基酸，USP26蛋白預(yù)期分子量為104 KDa。研究發(fā)現(xiàn)X染色體上存在許多可導(dǎo)致雄性不育的異常基因，其中就包括特異性表達(dá)于睪丸組織中的Usp6基因。2005年Stouffs等首次報道了Usp26基因突變與精子生成障礙的相關(guān)性，隨后一些研究也先后提出Usp26基因突變會引起男性不育。但另外一些研究認(rèn)為Usp26基因突變可能與精子生成障礙無關(guān)

2、。然而，上述研究大部分為觀察性研究，且USP26蛋白的功能也不十分清楚。本研究的目的是從分子水平研究分析野生型和突變型USP26蛋白的酶活性功能，以便了解Usp26基因突變的生物學(xué)意義。目前，有文獻(xiàn)報道的Usp26基因突變有23個，其中有15個突變位點本課題組已成功構(gòu)建并檢測了其對泛素特異性蛋白酶USP26活性的影響發(fā)現(xiàn)這些位點突變并未影響USP26的去泛素化酶活性，認(rèn)為Usp26基因中這15個突變位點可能與男性不育癥并不相關(guān)。為了確證

3、剩余8個突變位點(520 G＞T、565 G＞T、1037 T＞A、1498 G＞A、1549 C＞T、1609 C＞G、2182 A＞T和2195 T＞C)是否影響USP26的活性，本研究構(gòu)建了這8個突變位點的表達(dá)質(zhì)粒，采用已建立的去泛素化酶活性檢測體系檢測了各突變位點對USP26酶活性的影響，為進(jìn)一步了解Usp26基因突變在男性不育中的作用奠定分子基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1構(gòu)建pGEX-Usp26各種突變質(zhì)粒。以本室保存

4、的pGEX-Usp26 WT為模板，采用定點突變的方法構(gòu)建2個無義突變(520 G＞T、565 G＞T)及6個錯義突變(1037 T＞A、1498 G＞A、1549 C＞T、1609 C＞G、2182 A＞T和2195 T＞C)的重組質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶酶切法和DNA測序法鑒定突變型重組質(zhì)粒。
　　2構(gòu)建pAC-T7-Usp26各突變質(zhì)粒。采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ從已構(gòu)建的pGEX-Usp26各突變質(zhì)粒中切出Usp6基因目的片

5、段，將其克隆到pAC-T7載體質(zhì)粒，以構(gòu)建pAC-T7-Usp26各突變質(zhì)粒，并用SalⅠ和PstⅠ酶切鑒定。
　　3采用Ub-Met-β-gal和GST-Ub52兩種不同的模型底物對各突變型USP進(jìn)行去泛素化酶活性分析，底物蛋白檢測采用Western Blot法，利用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描觀察結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1 pGEX-Usp26突變質(zhì)粒的構(gòu)建:測序證實，質(zhì)粒中所插入的2742 bp片段為人

6、類基因Usp26的編碼區(qū)，其相應(yīng)位點突變得到了證實這些突變導(dǎo)致的氨基酸變化分別是:E174X（X:終止密碼子）(520 G＞T)、E189X(565 G＞T)、L346H(1037 T＞A)、E500K(1498 G＞A)、P517S(1549C＞T)、Q537E(1609 C＞G) I728F(2182 A＞T)以及F732S(2195 T＞C)。
　　2采用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和PstⅠ酶切鑒定構(gòu)建的pAC-T7-Usp26各

7、突變質(zhì)粒，均可產(chǎn)生大小分別為1.5 Kb和5.7 Kb的兩個片段，故成功構(gòu)建了pAC-T7-Usp26各突變質(zhì)粒。
　　3錯義突變(1037T＞A、1498 G＞A、1549 C＞T、1609 C＞G、2182 A＞T和2195 T＞C)對酶活性的影響:這6種突變型與USP26野生型一樣，均能使模型底物Ub-Met-β-gal和GST-Ub52去泛素化，即各位點突變均不影響USP26的去泛素化酶活性。
　　4無義突變520

8、G＞T和565 G＞T仍均能使模型底物Ub-Met-β-gal和GST-Ub52去泛素化，未影響USP26的去泛素化酶活性。理論上2個無義突變分別只能編碼Usp26的520個堿基和565個堿基（均不包括去泛素化酶活性中心），產(chǎn)生的蛋白應(yīng)不再具有去泛素化酶活性。實際結(jié)果與理論相反的可能原因是在大腸埃希菌等某些原核生物中即便編碼過程中有終止密碼子，若其后仍有起始密碼子-ATG-，則仍可跨越終止密碼子繼續(xù)向下編碼。
　　5構(gòu)建無義突變5

9、20* G＞T(522 bp)、565* G＞T(567 bp)，發(fā)現(xiàn)兩個突變型均不能去泛素化模型底物Ub-Met-β-gal及GST-Ub52，進(jìn)一步驗證了520 G＞T、565 G＞T位點突變?nèi)粢疝D(zhuǎn)錄終止，則均可導(dǎo)致USP26去泛素化酶活性消失。
　　結(jié)論:
　　1成功構(gòu)建了Usp26的2個無義突變(520 G＞T、565 G＞T)及6個錯義突變(1037 T＞A、1498 G＞A、1549 C＞T、1609 C＞G、