tatnlsnkx6.2融合蛋白在大腸桿菌中的表達純化及其對神經(jīng)干細胞分化的影響

1、分類號：Q 7 8密 級：學位類別： 科學學位囹 專業(yè)學位口學校代碼：1 0 0 6 2學 號：2 0 1 0 6 0 2 0 1 7學科門類：理學夭坪醬科矢垮 T l A N J l NM E D I C A L U N I V E R S I Ⅳ碩士學位論文M A S T E R ’S D I S S E R T A T I O N論文題目：T A T - N L S ．N k x 6 ．2 融合蛋白在大腸桿菌中的表達純化及其對神經(jīng)

2、干細胞分化的影響T IT L E E x p r e s s i o n a n dp u r i f i c a t i o n o fT A T - N L S - N k x 6 ．2f u s i o np r o t e i ni nE ．c o l ia n dt h ee f f e c t so n t h ed i f f e r e n t i a t i o n o fn e u r a ls t e m c e

3、l l s一級學科：生物學二級學科：生物化學與分子生物學論文作者：張欣指導教師：郭剛研究員導師組成員：張瑞助理研究員王寶利研究員天津醫(yī)科大學研究生院二O 一三年五月天津醫(yī)科大學碩士學位論文中文摘要目的：探討同源盒基因N k x 6 ．2 在因甲狀腺素缺乏導致腦發(fā)育遲滯過程中的分子作用機制，獲得能穿過血腦屏障的并跨膜進入細胞核的T N - N k x 6 ．2 重組蛋白。本文旨在觀察同源盒基因N k x 6 ．2 對神經(jīng)干細胞生長分化的影

4、響。為進一步深入探討同源盒基因N k x 6 ．2 在甲狀腺減低模型的作用機制奠定了物質基礎。方法：本實驗利用基因克隆技術，將T A T - N L S ．N k x 6 ．2 基因片段和空質粒p E T - 2 8 a分別進行雙酶切后，利用T 4 連接酶連接，將T A T - N L S - N k x 6 ．2 及N k x 6 。2 基因克隆入p E T - 2 8 a 表達載體中，構建重組質粒p E T - 2 8 a ．T N

5、 ．N k x 6 ．2 及p E T - 2 8 a - N k x 6 ．2 ，并將重組質粒p E T - 2 8 a ．T N ．N k x 6 ．2 及p E T - 2 8 a - N k x 6 ．2 轉化入克隆菌E ．c o l iD H 5 a 中，再轉化至E ．c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) 中表達，經(jīng)酶切及測序鑒定重組子，將酶切和測序正確的重組質粒保存于1 0 ％的甘油中，平板劃線，挑取單菌落于抗

6、K a n 的L B 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按1 ：5 0 接種于抗K a r l 的L B 液體培養(yǎng)基，當O D 值為0 ．6 左右時，用I P T G 誘導目的蛋白表達，并對誘導條件如誘導時間，誘導溫度，I P T G 濃度進行優(yōu)化，S D S ．P A G E 及W e s t e r n B l o t 鑒定融合蛋白，p E T - 2 8 a 載體帶有融合標簽H i s ·T a g ，融合標簽用于檢測和純化目的蛋白，經(jīng)

7、組氨酸N i 2 + 親和層析純化融合蛋白。將融合蛋白T N ．N k x 6 ．2 ，N k x 6 ．2 分別以不同濃度與神經(jīng)干細胞孵育，免疫熒光細胞化學檢測分化后的細胞類型，抗體分別為N F ．2 0 0 、G F A P 、G a l ．C 。結果：經(jīng)酶切和測序證實成功構建了重組質粒p E T - 2 8 a ．T N ．Ⅻ( ) 【6 ．2 及p E T - 2 8 a ．N k x 6 ．2 ，按1 ：5 0 的接種量接入搖

8、瓶，3 7 0 C ，2 5 0 r ／r a i n 培養(yǎng)約4 h ，當菌液的O D值為0 ．6 時，增添終濃度為l m m o l ／L 的誘導劑I P T G 在2 5 。c 誘導8 h 后，融合蛋白的產(chǎn)量最高，能夠在E ．c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) 中高效表達融合蛋白T N ．N k x 6 ．2 ，經(jīng)S D S ．P A G E 電泳分析，結果顯示目的蛋白的表達帶的分子量與預期相符，經(jīng)組氨酸N i 2

9、+ 親和層析純化，得到高純度的融合蛋白，經(jīng)W e s t e r n B l o t 鑒定，純化后的融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反應性，融合蛋白為T N - N k x 6 ．2 和N k x 6 。2 ，融合蛋白T N - N k x 6 ．2 能穿過細胞膜進入神經(jīng)干細胞影響神經(jīng)干細胞的分化，經(jīng)熒光顯微鏡觀察G a l ．C 的陽性細胞超過7 5 ％，有助于向少突膠質細胞方向發(fā)展，尤其以增加2 0 0 } ，t g ／L 、5 0