液態(tài)藥物載藥法制備10-羥基喜樹(shù)堿白蛋白納米粒以及其初步體內(nèi)外評(píng)價(jià).pdf

1、背景:白蛋白納米給藥系統(tǒng)（Albumin nano drug delivery system，ANPs-DDS）是以白蛋白為基質(zhì)材料制備的納米制劑，具有很多優(yōu)良的特性。例如一類(lèi)材料人血白蛋白(Huma serum albumin,HSA)，其屬于內(nèi)源性物質(zhì)，其具有無(wú)毒、無(wú)免疫源性、生物可降解和生物相容性高的特點(diǎn)。同時(shí)在體內(nèi)很多藥物都具有與血漿蛋白結(jié)合的能力，因此白蛋白為天然的理想藥物載體。結(jié)合日趨受到關(guān)注的納米給藥(Nano drug

2、deliverysystem,NDDS)系統(tǒng)的發(fā)展，制備以人血白蛋白為基質(zhì)的納米粒(Huma serum albuminnanoparticles，HSA-NPs)以及給藥系統(tǒng)已受到多方重視。隨著American Bioscience的專(zhuān)利產(chǎn)品人血白蛋白納米粒紫杉醇制劑Abraxane(R)的上市，白蛋白納米制劑已成為新型納米制劑的代表，具有巨大的市場(chǎng)潛力。
　　喜樹(shù)堿(camptothecin，CPT)類(lèi)藥物是天然植物喜樹(shù)科當(dāng)中

3、提取的具有抗癌活性的化學(xué)成分，其主要靶向抑制癌細(xì)胞核當(dāng)中的拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅰ。防止癌細(xì)胞的拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅰ對(duì)癌細(xì)胞DNA單鏈異構(gòu)的作用，阻礙DNA的復(fù)制與合成，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。10-羥基喜樹(shù)堿（10-hydroxycamptothecin，HCPT）是喜樹(shù)堿的10位羥基衍生物，較CPT而言，針對(duì)臨床上的胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌具有較好的抗癌活性。但由于喜樹(shù)堿類(lèi)藥物本身的理化性質(zhì)不理想，不溶于水，在生理及堿性條件下易由高

4、治療活性的內(nèi)酯環(huán)開(kāi)環(huán)形成高毒性而低治療作用的羧酸形式。因此傳統(tǒng)的注射液(pH值為10的液體注射液)并沒(méi)有較好的臨床療效。進(jìn)而影響了該藥物的廣泛應(yīng)用。通過(guò)新型納米藥物制劑技術(shù)的發(fā)展，這一問(wèn)題逐步得到解決，其中發(fā)展了納米晶體、脂質(zhì)體、微乳等劑型。人血白蛋白納米制劑也同樣得到重視，目前雖然大量的文獻(xiàn)已報(bào)道HCPT類(lèi)藥物的白蛋白納米制劑，但由于羥基喜樹(shù)堿在二氯甲烷、氯仿和豆油等有機(jī)相中溶解度不高，并不適用于現(xiàn)有廣泛應(yīng)用的乳化法和Nab-tech

5、nology載藥法?，F(xiàn)有方法存在載藥效率低、毒性試劑的引入（有機(jī)相和毒性交聯(lián)劑等）等問(wèn)題，因此該藥物制備成為白蛋白載藥納米粒仍存在技術(shù)壁壘。
　　目的:為克服載藥效率低和毒性試劑引入等問(wèn)題以及探索創(chuàng)新型載藥方式。本研究開(kāi)展了以?xún)?nèi)源性還原態(tài)谷胱甘肽(Reduced-glutathione，r-GSH)為交聯(lián)劑制備的空白HSA-NPs并結(jié)合低分子量聚乙二醇（Low weight polyethylene glycol，1-PEG）HC

6、PT復(fù)合物載藥法首次實(shí)現(xiàn)干燥條件下載藥的研究，具有一定的創(chuàng)新性。該方法通過(guò)1-PEG與目標(biāo)分子HCPT形成廣泛的氫鍵作用，進(jìn)而提高該藥物在其中的溶解度，形成高含量的HCPT液態(tài)藥物復(fù)合物，結(jié)合該復(fù)合物的特殊性質(zhì)開(kāi)展載藥研究。
　　方法:為成功制備以人血白蛋白為載體的10-羥基喜樹(shù)堿納米粒(HCPT-HSA-NPs)，本課題首先針對(duì)r-GSH制備空白HSA-NPs并進(jìn)行條件優(yōu)化和探索。對(duì)蛋白液濃度、乙醇比例和制備流程進(jìn)行優(yōu)化，成功制

7、備粒徑小于200nm，性質(zhì)穩(wěn)定的空白HSA-NPs。接下來(lái)本研究針對(duì)1-PEG與HCPT復(fù)合物制備的參數(shù)進(jìn)行考察和研究，得到穩(wěn)定的1-PEG-HCPT，該復(fù)合物具有較高的HCPT濃度(80mg/ml)并具有遇水極易析出的特性。進(jìn)而開(kāi)展1-PEG-HCPT復(fù)合物在干燥條件下與HSA-NPs凍干粉末混合載藥工藝的初步研究，得出基本載藥步驟:(1)經(jīng)凝聚法制備以還原性谷胱甘肽為交聯(lián)劑的HSA-NPs，并進(jìn)行凍干處理。(2)利用乙醇為溶媒將HC

8、PT與1-PEG在低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)條件下制備1-PEG-HCP。(3)在干燥條件下將HSA-NPs凍干粉末與液態(tài)藥物復(fù)1-PEG-HCP進(jìn)行充分?jǐn)嚢琛D壓混合。(4)再將該混合物重新分散至水環(huán)境中得到較理想的HCPT-HSA-NPs。
　　對(duì)制備得到的樣品進(jìn)行體內(nèi)、體外表征評(píng)價(jià)，深入闡述和解釋該載藥方法的機(jī)理和可行性。通過(guò)體外表征的項(xiàng)目如:粒徑、分布、Zeta電位、含量、復(fù)合物性質(zhì)考察、形態(tài)觀察、釋放速率測(cè)定、穩(wěn)定性考察、溶液物理穩(wěn)定

9、性考察、X-ray粉末衍射(X-ray powderdiffraction，XRD)示差掃描量熱法（Differential scanning calorimetry, DSC）等方法證明HCPT與HSA-NPs結(jié)合的方式以及載藥原理。并通過(guò)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)比HCPT-HSA-NPs與傳統(tǒng)HCPT注射液的體內(nèi)、外行為，以證明該制備方法的可行性。
　　結(jié)果:證明制備的HCPT-HSA-NPs符合

10、納米制劑的形態(tài)學(xué)和體積要求，經(jīng)液態(tài)藥物復(fù)合物法制備的納米粒具有高包封率（Entrapment efficiency, EE）（平均高于99％），平均粒徑低于200nm，含量可達(dá)7％;制備過(guò)程引入試劑毒性較小（乙醇、谷胱甘肽、低分子量聚乙二醇）;多分散系數(shù)（Polydispersity index，PDI）結(jié)果證明該納米制劑分布較窄。Zeta電位符合溶液穩(wěn)定性要求。該HCPT-HSA-NPs具有體外緩釋作用，釋放周期達(dá)100小時(shí)。溶液物理

11、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)提供了載藥機(jī)制的可行性的證據(jù)并證明了HSA-NPs的載體功能。同時(shí)XRD和DSC結(jié)果證明1-PEG-HCPT可以成功的將HCPT遞送到HSA-NPs的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。各結(jié)果系統(tǒng)的證明了利用液態(tài)HCPT復(fù)合物載藥法依據(jù)1-PEG-HCPT高含量和遇水極易析出的性質(zhì)所制定的載藥策略的可行性。同時(shí)制備得到的HCPT-HSA-NPs在細(xì)胞毒試驗(yàn)、異種瘤移植抑制實(shí)驗(yàn)和藥物體內(nèi)分布等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到印證。體內(nèi)體外結(jié)果表明該方法可以成功將HC

12、PT包載到人血白蛋白納米上并在體內(nèi)發(fā)揮作用，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明HCPT-HSA-NPs較HCPT注射劑具有顯著提升，體內(nèi)抑瘤效果顯著高于傳統(tǒng)注射制劑(傳統(tǒng)注射劑為21.45％，HCPT-HSA-NPs為40.63％，p＜0.01)等優(yōu)勢(shì)。
　　結(jié)論:同時(shí)與現(xiàn)有HCPT白蛋白納米粒制備方便相比較，具有一定的優(yōu)勢(shì)。其相對(duì)于傳統(tǒng)的乳化法、pH調(diào)節(jié)沉淀法等具有較低的毒性試劑引入、較高的包封率以及較少的投料比例。同時(shí)該方法為解決類(lèi)似HCPT理