基于系統(tǒng)藥理學(xué)方法研究大黃酸治療腎小管間質(zhì)纖維化的作用機制.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitial fibrosis，TIF），是各種慢性腎病進展到終末期的共同病理過程，其病理進程是在時間和空間尺度上不斷累積的一個過程。目前，對腎臟纖維化病程的評估主要采取創(chuàng)傷的腎活檢，臨床上也尚無針對腎小管間質(zhì)纖維化的特效藥物。大黃酸具有明顯的抗纖維化作用，對腎小管間質(zhì)纖維化的治療是從分子水平出發(fā)，反映到細胞、組織和器官的一種調(diào)控。作為一個多靶點的成分，大黃酸作用靶點形成的生物網(wǎng)絡(luò)是復(fù)雜的。因此

2、，如何動態(tài)模擬該疾病的發(fā)生和發(fā)展，并且系統(tǒng)地研究大黃酸作用于生物網(wǎng)絡(luò)在不同尺度上的聯(lián)系對于腎小管間質(zhì)纖維化的治療具有重要意義。系統(tǒng)藥理學(xué)能夠從時間到空間系統(tǒng)地建立一個藥物對機體的作用在不同尺度之間的相互關(guān)聯(lián)。運用系統(tǒng)藥理學(xué)去研究藥物的機制往往涉及到藥物靶點的鑒別、疾病網(wǎng)絡(luò)模型的建立和分析以及多尺度系統(tǒng)的整合等技術(shù)。本論文運用系統(tǒng)藥理學(xué)的方法研究大黃酸治療腎小管間質(zhì)纖維化的作用機制。分為以下兩個部分：
　　本文第一部分應(yīng)用正（反）分

3、子對接、網(wǎng)絡(luò)分析等虛擬方法和表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）實驗方法識別了大黃酸的新靶點，結(jié)合基因富集分析提出了大黃酸可能的藥物作用機制。首先，從ZINC數(shù)據(jù)庫下載大黃酸配體的三維分子結(jié)構(gòu)，應(yīng)用 PharmMapper數(shù)據(jù)庫進行反向分子對接，初步篩選大黃酸潛在靶點；在此基礎(chǔ)上，以陽性藥物為對照，執(zhí)行正向分子分子對接，進一步篩選大黃酸潛在靶點。同時收集整合STITCH數(shù)據(jù)庫的大黃酸已知靶點。用C

4、ytoscape軟件構(gòu)建大黃酸作用靶點網(wǎng)絡(luò)。將得到的網(wǎng)絡(luò)進行擴展，計算網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，據(jù)此篩選大黃酸候選靶點。然后，通過 SPR實驗驗證了其中一個未被文獻報道的候選靶點 LCK。最后，對上述靶點進行富集分析，構(gòu)建富集通路整合網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，LCK、HSP90AA1、RAB5A、EGFR、CDK2、CDK6、GSK3B、p38和 JNK這9個大黃酸候選靶點被富集。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，大黃酸的治療作用是多條信號通路協(xié)同和綜合的結(jié)果，多個靶點的擾動賦

5、予了大黃酸多種有效的藥理活性。
　　在論文的第二部分，通過建立多個尺度的數(shù)學(xué)模型，動態(tài)模擬腎小管間質(zhì)纖維化疾病進程，并通過大黃酸干預(yù)模擬，進一步揭示大黃酸治療腎小管間質(zhì)纖維化的作用機制。首先，分別構(gòu)建了細胞和分子兩個尺度上的模型。在細胞水平上，實驗采用基于主體的模型（Agent-based model，ABM），通過規(guī)定其細胞之間相互作用的規(guī)則，模擬1 mm×1 mm的二維腎皮質(zhì)部分。在分子水平上，構(gòu)建了細胞內(nèi)的分子網(wǎng)絡(luò)常微分方程

6、（Ordinary differential equation，ODE）模型和細胞外的擴散和降解偏微分方程（Partial differential equation，PDE）模型，實時動態(tài)模擬單個細胞內(nèi)大分子的變化。然后，通過兩個水平之間相關(guān)分子的信息交互，連接這兩個尺度的模型，從而實現(xiàn)從系統(tǒng)的水平去模擬腎小管間質(zhì)纖維化。隨后，通過大黃酸干預(yù)，從多個尺度觀察其對疾病的作用。結(jié)果顯示，在低濃度TGF-β（1 ng/mL）的刺激下，模型未

7、出現(xiàn)纖維化癥狀，腎小管保存完整，成纖維細胞也處于正常數(shù)量，沒有肌成纖維細胞產(chǎn)生，沒有巨噬細胞募集。而在高濃度TGF-β（10 ng/mL）的刺激下，模型大面積呈現(xiàn)纖維化瘢痕，腎小管完全破壞，小管上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，巨噬細胞隨時間逐漸增加。大黃酸干預(yù)能明顯減緩在高濃度 TGF-β刺激下的腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)展