谷氨酸棒桿菌中分枝硫醇二硫還原酶(Mtr)的抗環(huán)境脅迫作用機制研究.pdf

1、谷氨酸棒桿菌作為一種重要的工業(yè)微生物，其在進行微生物發(fā)酵過程中，不可避免地會受到來自發(fā)酵環(huán)境的各種脅迫，進而對其發(fā)酵能力和產(chǎn)物產(chǎn)生不良影響。環(huán)境脅迫會通過提高胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的水平來打破原有的氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而對生物大分子造成損傷最終導致細胞死亡。因此增強谷氨酸棒桿菌在不良環(huán)境下的耐受性和魯棒性已成為提高其工業(yè)發(fā)酵能力的關(guān)鍵措施。為應對氧化脅迫壓力微生物已進化出兩套抗氧化防御系統(tǒng):非酶

2、和酶系統(tǒng)，后者主要包括觸酶(Cat)、超氧化物歧化酶(SOD)、硫氧還原蛋白(Trx)、分枝硫醇二硫還原酶(Mtr)等。其中，Mtr是催化氧化態(tài)分枝硫醇(MSSM)為還原態(tài)分枝硫醇(MSH)的關(guān)鍵酶，在維持細胞的氧化還原態(tài)平衡和抗氧酶活性中起關(guān)鍵作用。然而目前關(guān)于谷氨酸棒桿菌中Mtr的生理生化功能的研究甚少，谷氨酸棒桿菌中MSH的生理功能更是無人問津。因而，在本研究中，我們以谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamic

3、um）中的Mtr為研究目標，發(fā)現(xiàn)了Mtr內(nèi)在生理功能以及其發(fā)揮這些功能的生化機理，詳細論文結(jié)果如下:
　　1.本研究在構(gòu)建Mtr突變株時，進行了8000個雙交換目的菌株的篩選之后，發(fā)現(xiàn)最終篩選過程雙交換目的菌株都會恢復至野生型，因此得出Mtr在C.glutamicum中是必需的基因。
　　2.在構(gòu)建了Mtr過表達菌株WT(pXMJ19-His6-mtr)的基礎(chǔ)上，測定了過表達菌株與野生型菌株WT(pXMJ19)在能誘導胞內(nèi)產(chǎn)

4、生ROS的不同氧化劑，烷化劑，抗生素和重金屬等脅迫劑處理下的存活率，結(jié)果表明，過表達Mtr能明顯增強C.glutamicum的抗環(huán)境脅迫能力，揭示了Mtr在C.glutamicum中的生理功能。
　　3.通過比較過表達Mtr菌株與野生型菌株在不同脅迫劑處理下胞內(nèi)的ROS水平及蛋白質(zhì)的羰基化水平，本研究發(fā)現(xiàn)過表達Mtr能明顯降低處于氧化應激狀態(tài)下的胞內(nèi)ROS水平，并且降低胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化水平。
　　4.通過比較WT(pXMJ1

5、9-His6-mtr)和WT(pXMJ19)在不同脅迫條件下胞內(nèi)蛋白質(zhì)可逆硫醇化修飾水平和MSH∶MSSM比例，發(fā)現(xiàn)過表達Mtr能明顯增加胞內(nèi)蛋白質(zhì)的可逆硫醇化修飾水平和提高MSH∶MSSM比例，進而在逆境條件下對蛋白質(zhì)進行保護、維持胞內(nèi)較高的MSH水平及合適的氧化還原環(huán)境。
　　5.通過比較WT(pXMJ19-His6-mtr)和WT(pXMJ19)在不同脅迫條件下，胞內(nèi)某些抗氧酶的活性及表達水平，本論文發(fā)現(xiàn)過表達Mtr會增強胞

6、內(nèi)某些抗氧酶的活性并上調(diào)這些抗氧酶的表達，進而增強C.glutamicum的魯棒性。
　　6.β-半乳糖苷酶活性和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗，發(fā)現(xiàn)Mtr的表達受到ROS的誘導并且受SigH蛋白的正調(diào)控，凝膠阻滯遷移實驗(EMSA)證明SigH可直接的、特異的結(jié)合到mtr啟動子區(qū)域?qū)ζ溥M行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)C.glutamicum中Mtr具有抗環(huán)境脅迫的生理功能，而發(fā)揮其生理功能的內(nèi)在機制，