A群鏈球菌CovRS雙組份系統(tǒng)致病機(jī)制研究.pdf

1、A群鏈球菌(Group A Streptococcus，GAS)是引起人類細(xì)菌感染的最重要病原之一。據(jù)2011年數(shù)據(jù)顯示，全球每年大概有7億例GAS引起的輕微、局部感染病例，其中約65萬(wàn)例轉(zhuǎn)化為嚴(yán)重侵襲性感染（嚴(yán)重全身性感染），最后導(dǎo)致約四分之一的感染者死亡。A群鏈球菌感染可以引起相對(duì)輕微感染，主要有咽喉炎、急性扁桃體炎、猩紅熱、皮膚軟組織感染、膿包病。它也可導(dǎo)致嚴(yán)重的侵襲性感染，如中毒性休克綜合征和壞死性筋膜炎。該菌也可能造成非化膿性

2、后遺癥，如風(fēng)濕性心臟病和急性腎小球腎炎。由于GAS血清型的復(fù)雜性以及疫苗的安全性問(wèn)題，目前尚無(wú)針對(duì)GAS的商業(yè)化疫苗。近年來(lái)由GAS引起的猩紅熱和嚴(yán)重全身性感染的發(fā)病率有所增長(zhǎng)，引起了人們對(duì)該類細(xì)菌感染的更多關(guān)注。盡管研究者圍繞GAS的毒力因子及致病機(jī)制已開(kāi)展了大量研究工作，但目前對(duì)GAS導(dǎo)致侵襲性感染的致病機(jī)理和局部感染向侵襲性感染轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制尚不清楚。因此，進(jìn)一步研究GAS在侵襲性感染過(guò)程中的固有免疫逃逸機(jī)制和了解GAS如何從局部

3、感染轉(zhuǎn)化為侵襲性感染的分子機(jī)制將有利于發(fā)現(xiàn)新的抗感染靶點(diǎn)和建立侵襲性感染早期診斷方法，對(duì)于有效預(yù)防和控制嚴(yán)重侵襲性感染具有重要意義。本研究使用從A群鏈球菌中毒性休克綜合征和壞死性筋膜炎等危及生命的感染病例中分離頻率最高的M1T1血清型代表菌株進(jìn)行侵襲性感染致病機(jī)制研究。第一，發(fā)現(xiàn)GAS可以通過(guò)CovRS雙組份調(diào)控系統(tǒng)抑制中性粒細(xì)胞向感染部位募集以增強(qiáng)其侵襲能力，也解釋了侵襲性感染臨床分離株MGAS5005中covS基因的天然無(wú)義突變是導(dǎo)

4、致該菌株中性粒細(xì)胞募集抑制能力、侵襲能力和毒力增強(qiáng)的主要原因。第二，用侵襲性感染模型評(píng)估了三個(gè)受CovRS雙組份系統(tǒng)調(diào)控的中性粒細(xì)胞募集抑制因子在侵襲性感染過(guò)程中的重要性。第三，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在M1T1血清型GAS引起的局部感染轉(zhuǎn)化為侵襲性感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。第四，進(jìn)一步完善M1T1血清型GAS引起的局部感染轉(zhuǎn)化為侵襲性感染的分子模型。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 ⑴建立M1T1血清型GAS侵襲性感染模型。首先用臨床分離的侵襲

5、性感染代表菌株MGAS5005和咽炎感染代表菌株MGAS2221通過(guò)皮下接種的方式感染小鼠，建立侵襲性感染研究模型。在該模型中，與咽炎感染代表菌株MGAS2221相比，侵襲性感染代表菌株MGAS5005具有較強(qiáng)的毒力和軟組織侵襲能力，并且感染部位缺少中性粒細(xì)胞。該表型與嚴(yán)重侵襲性感染----壞死性筋膜炎感染部位缺少中性粒細(xì)胞的臨床表現(xiàn)一致，表明該動(dòng)物模型成功模擬了侵襲性感染的臨床表型，為侵襲性感染致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　

6、 ⑵M1T1血清型GAS通過(guò)CovRS雙組份系統(tǒng)抑制中性粒細(xì)胞向感染部位募集以增強(qiáng)其侵襲能力和毒力。首先通過(guò)同源重組的方法將野生型covSwt基因置換MGAS5005基因組中天然無(wú)義突變的covSΔ1bp基因，構(gòu)建MGAS5005wtcovS回復(fù)菌株。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明MGAS5005wtcovS顯著降低了毒力和侵襲能力，并且在感染區(qū)域募集了大量中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞含量與咽炎感染代表菌株MGAS2221感染部位募集的中性粒細(xì)胞水平相當(dāng)。相反

7、，MGAS2221⊿covS突變株毒力和侵襲能力顯著增強(qiáng)，感染部位募集的中性粒細(xì)胞含量降低至MGAS5005相似的水平。該結(jié)果表明，GAS通過(guò)CovRS雙組份系統(tǒng)抑制中性粒細(xì)胞向感染部位募集，并因此增強(qiáng)侵襲能力和毒力。上述結(jié)果也解釋了侵襲性感染分離菌株MGAS5005中covS基因的天然無(wú)義突變是導(dǎo)致其抑制中性粒細(xì)胞募集能力和毒力增強(qiáng)的主要原因。通過(guò)檢測(cè)患者感染部位分離菌株的covRS基因是否發(fā)生突變，或許可以成為一種侵襲性感染的輔助預(yù)

8、測(cè)方法。
　　 ⑶鏈球菌分泌性酯酶(SsE)是侵襲性感染中重要的中性粒細(xì)胞募集抑制因子和毒力因子。研究結(jié)果證明在GAS侵襲性感染過(guò)程中，CovRS雙組份系統(tǒng)參與抑制中性粒細(xì)胞向感染部位募集。CovRS雙組份系統(tǒng)需要通過(guò)調(diào)控下游基因?qū)崿F(xiàn)抑制中性粒細(xì)胞募集的功能。白介素-8蛋白酶(SpyCEP)、C5a肽酶(ScpA)和分泌性酯酶(SsE)是受CovRS負(fù)調(diào)控的中性粒細(xì)胞募集抑制因子。為了分析和比較中性粒細(xì)胞募集抑制因子SpyCEP

9、、ScpA和SsE在侵襲性感染過(guò)程中的重要性，本研究以侵襲性感染代表菌株MGAS5005為親本菌株，通過(guò)同源重組的方法分別構(gòu)建這三個(gè)基因的單基因缺失突變株，雙基因缺失突變株⊿spyCEP⊿scpA，⊿scpA⊿sse，⊿spyCEP⊿sse和三基因缺失突變株⊿spyCEP⊿scpA⊿sse。通過(guò)侵襲性感染模型，對(duì)單基因缺失突變株、雙基因缺失突變株和三基因缺失突變株一共7個(gè)突變株同時(shí)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):凡是缺失了sse基因的突變株（包括單基因、

10、雙基因和三基因缺失突變株），中性粒細(xì)胞募集抑制能力和毒力都顯著降低;然而，spyCEP和scpA這兩個(gè)基因的單基因和雙基因缺失突變株的中性粒細(xì)胞募集抑制能力和毒力與野生株相比沒(méi)有顯著變化;并且三個(gè)因子之間沒(méi)有協(xié)同增強(qiáng)中性粒細(xì)胞募集抑制能力和毒力的效應(yīng)。以上結(jié)果證明SsE不僅是GAS侵襲性感染過(guò)程中抑制中性粒細(xì)胞募集的重要因子，而且是GAS侵襲性感染過(guò)程中的重要的毒力因子。通過(guò)開(kāi)發(fā)針對(duì)該毒力因子的藥物或者治療性單克隆抗體，有希望用于治療侵

11、襲性感染。將該毒力因子的表達(dá)水平與GAS侵襲性感染嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)，有潛力發(fā)展為疾病嚴(yán)重程度的評(píng)判指標(biāo)。
　　 ⑷中性粒細(xì)胞在咽炎感染代表菌株轉(zhuǎn)化成強(qiáng)侵襲性菌株的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，某些GAS菌株在小鼠體內(nèi)傳代后，covRS基因可能發(fā)生突變。covRS基因突變的菌株不能分泌廣譜半胱氨酸蛋白酶(SpeB)，因此本文將該類菌株簡(jiǎn)稱為SpeB陰性菌株（SpeB-菌株）。本研究將咽炎代表菌株MGAS2221(SpeB陽(yáng)性菌株)

12、進(jìn)行皮下感染，發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，從感染部位分離到的SpeB陰性突變菌株（SpeB-菌株）比例越來(lái)越高，具有體內(nèi)生存優(yōu)勢(shì)。體外生長(zhǎng)曲線和體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)感染實(shí)驗(yàn)共同表明SpeB-菌株在體內(nèi)的生存優(yōu)勢(shì)并不是生長(zhǎng)速率導(dǎo)致的，而是因?yàn)镾peB-菌株在感染部位具有更強(qiáng)的抵抗炎癥細(xì)胞清除能力。通過(guò)RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，與MGAS2221相比，SpeB-菌株中spyCEP、hasA和sse等基因的表達(dá)水平均顯著升高。在小鼠軟組織感染模型中證明，與親本菌

13、株MGAS2221相比，SpeB-菌株具有更強(qiáng)的毒力、中性粒細(xì)胞募集抑制能力和侵襲能力。以上結(jié)果表明在小鼠體內(nèi)傳代，可以誘導(dǎo)咽炎感染代表菌株MGAS2221“轉(zhuǎn)化”成為具有強(qiáng)中性粒細(xì)胞募集抑制能力、強(qiáng)侵襲能力和強(qiáng)毒力的SpeB-菌株。為了研究宿主中性粒細(xì)胞在該“轉(zhuǎn)化”過(guò)程中發(fā)揮的作用，本研究采用缺乏中性粒細(xì)胞的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，分別通過(guò)抗Gr-1和抗Ly6G的兩種單克隆抗體消除正常小鼠感染部位中性粒細(xì)胞，兩種抗體處理的結(jié)果均表明中性粒

14、細(xì)胞在該“轉(zhuǎn)化”過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其次，使用中性粒細(xì)胞殺傷能力有缺陷的gp91phox-/-基因缺陷型小鼠再次確定中性粒細(xì)胞在該“轉(zhuǎn)化”過(guò)程中起到重要作用。此外，為了排除炎癥單核細(xì)胞在該過(guò)程中產(chǎn)生的影響，本研究使用炎癥單核細(xì)胞不能從骨髓進(jìn)入血液的CCR2-/-基因缺陷型小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明炎癥單核細(xì)胞并未對(duì)“轉(zhuǎn)化”過(guò)程產(chǎn)生影響。
　　 ⑸本研究進(jìn)一步完善了M1T1血清型GAS引起的局部感染向侵襲性感染轉(zhuǎn)化的理論模型。①在建立

15、感染之初，GAS不僅需要正常的CovRS雙組份系統(tǒng)來(lái)感應(yīng)環(huán)境變化并迅速調(diào)控下游基因表達(dá)，同時(shí)需要分泌廣譜半胱氨酸蛋白酶(SpeB)來(lái)破壞機(jī)體的第一道屏障（如咽喉或皮膚上皮細(xì)胞）。②當(dāng)GAS突破第一道屏障之后，機(jī)體在感染部位募集大量中性粒細(xì)胞來(lái)清除GAS，此時(shí)GAS將通過(guò)各種免疫逃逸機(jī)制來(lái)抵抗免疫系統(tǒng)的清除。③其中，covRS基因發(fā)生突變將使得免疫逃逸相關(guān)的因子能夠大量表達(dá)，因此具有較強(qiáng)的固有免疫逃逸能力，獲得了體內(nèi)生存優(yōu)勢(shì)。④成功免疫逃