遠(yuǎn)志皂苷生物合成中CYP450s、UGTs的篩選及遠(yuǎn)志對(duì)hDDC酶抑制作用初探.pdf

1、選題依據(jù)：遠(yuǎn)志皂苷作為遠(yuǎn)志藥材中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，具有安神益智、鎮(zhèn)靜祛痰、抗抑郁、抗衰老、抗老年癡呆等藥理作用。遠(yuǎn)志皂苷藥理活性的多樣性使其特別適合開發(fā)成為具有抗衰老和腦保護(hù)作用新藥的先導(dǎo)化合物，但其從藥材中的提取率極低，且尚未建立人工合成方法，這已嚴(yán)重制約了相關(guān)藥物的開發(fā)。因此闡明遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑，將對(duì)于在體外生物合成大量遠(yuǎn)志皂苷具有重要意義。
　　本課題組前期研究已證明遠(yuǎn)志皂苷生物合成

2、上游是通過甲羥戊酸（MVA）途徑完成的，中游的鯊烯合成酶（SQS）和角鯊烯環(huán)氧酶（SQE）與下游合成遠(yuǎn)志皂苷的前體的β-香樹脂合酶（β-AS）密切相關(guān)，但后期還需經(jīng)過植物細(xì)胞色素單加氧酶P450（CYP450s）與糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）的修飾生成遠(yuǎn)志皂苷。由于 CYP450s、UGTs是較大的酶家族，所以目前遠(yuǎn)志皂苷下游途徑仍不清晰，因此篩選遠(yuǎn)志皂苷下游途徑中的CYP450s、UGTs酶基因是闡明遠(yuǎn)志皂苷整條生物合成途徑的關(guān)鍵所在。

3、r>　　目前，已有研究證明遠(yuǎn)志對(duì)于帕金森?。≒D）有一定的治療作用，但上述對(duì)遠(yuǎn)志抗PD的研究是基于動(dòng)物體內(nèi)及細(xì)胞水平上，具有造模周期長、影響因素多、經(jīng)濟(jì)成本高等缺點(diǎn)，并且缺少在蛋白水平上的相關(guān)研究。因此，建立一種體外多巴脫羧酶（hDDC）特異抑制劑的篩選模型將有助于遠(yuǎn)志抗PD藥理作用的深入研究。
　　目的：
　　1.獲得遠(yuǎn)志根與葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步豐富遠(yuǎn)志基因資源，篩選遠(yuǎn)志皂苷的生物合成下游途徑中關(guān)鍵酶基因—CYP450s

4、與 UGTs。
　　2.復(fù)制并建立一種體外hDDC特異抑制劑的篩選模型，用于探討遠(yuǎn)志的抗PD的藥理作用。
　　方法：
　　1.應(yīng)用數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）測(cè)序技術(shù)分別對(duì)遠(yuǎn)志皂苷含量差異較大的根與葉組織，平行三次進(jìn)行測(cè)序，得到遠(yuǎn)志根與葉中的差異表達(dá)基因，篩選出遠(yuǎn)志根中上調(diào)的酶基因。
　　2.基于遠(yuǎn)志根與葉的 DGE數(shù)據(jù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）技術(shù)對(duì)涉及遠(yuǎn)志三萜皂苷生物合成途徑的22條基因（17條

5、 CYP450s與5條UGTs）在遠(yuǎn)志根與葉中表達(dá)水平進(jìn)行分析，通過相關(guān)性分析得到參與遠(yuǎn)志皂苷生物合成下游途徑的關(guān)鍵CYP450s和UGTs酶基因。
　　3.采用hDDC與PEPC聯(lián)合酶活測(cè)定體系建立 hDDC特異抑制劑的篩選模型，對(duì)遠(yuǎn)志的不同提取物（95％乙醇提取物與水提物）和不同萃取部位（石油醚部位、乙酸乙酯部位、氯仿部位、正丁醇部位、萃取水部位）進(jìn)行了初步活性篩選。
　　結(jié)果：
　　1.本研究通過遠(yuǎn)志根與葉平行三

6、次的DGE測(cè)序，分別得到了遠(yuǎn)志根與葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。遠(yuǎn)志根與葉中分別得到高質(zhì)量 Reads數(shù)目為60,437,865與61,926,272，通過拼接共得到494,113條 contigs、298,586條 transcripts、64,171條unigene，對(duì)前期遠(yuǎn)志的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了補(bǔ)充和完善。
　　2.構(gòu)建了遠(yuǎn)志根與葉的DGE數(shù)據(jù)庫，遠(yuǎn)志根與葉三次測(cè)序平行性較好，遠(yuǎn)志根與葉中差異表達(dá)的Unigene共6943條，占總數(shù)的10.

7、88%；根中上調(diào)的差異表達(dá)基因通過KEGG注釋到三萜皂苷生物合成途徑中的分別是PMK、FPPS和β-AS；篩選出參與遠(yuǎn)志皂苷合成下游途徑的共有22個(gè)酶基因（17條CYP450s與5條UGTs）。
　　3.基于遠(yuǎn)志根與葉的DGE數(shù)據(jù)，采用RT-qPCR法對(duì)遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑涉及的22條基因在遠(yuǎn)志根與葉中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，并結(jié)合相關(guān)性分析進(jìn)一步篩選出6個(gè)酶基因，CYP71A1、CYP94A2、CYP714C2、CYP78A9、CY

8、P734A6（CYP734A1）、UGT73C4與遠(yuǎn)志皂苷生物合成下游途徑緊密相關(guān)，DGE測(cè)序結(jié)合RT-qPCR技術(shù)可以有效的篩選遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因以及發(fā)現(xiàn)新基因。
　　4.通過復(fù)制并建立hDDC特異抑制劑的篩選模型，對(duì)遠(yuǎn)志的不同提取物和不同萃取部位進(jìn)行了初步活性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志氯仿萃取部位對(duì) hDDC表現(xiàn)出一定的抑制作用，提示上述提取物與萃取部位可能具有抗 PD的作用，體外 hDDC特異抑制劑的篩選模型可以用于

9、后續(xù)的高通量活性篩選。
　　結(jié)論：CYP71A1、CYP94A2、CYP714C2、CYP78A9、CYP734A6（CYP734A1）和UGT73C4與遠(yuǎn)志皂苷生物合成下游途徑緊密相關(guān)，這對(duì)遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑的闡明提供了科學(xué)依據(jù)。此外，通過體外 hDDC特異抑制劑的篩選模型得到遠(yuǎn)志氯仿萃取部位可能具有抗PD的作用，這不僅為上述部位中有效化學(xué)成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定奠定了科學(xué)基礎(chǔ)，也為遠(yuǎn)志發(fā)揮抗 PD的藥理作用及機(jī)制的研究提供了一種