顆粒裂解肽G13結(jié)構(gòu)域的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、顆粒裂解肽(Granulysin)是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞CTL和天然殺傷細(xì)胞NK內(nèi)的顆粒中含有的一種多肽,天然顆粒裂解肽和重組顆粒裂解肽都具有廣譜抗菌活性。對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲等均具有殺傷活性,尤其是對(duì)分枝桿菌有直接的細(xì)胞毒性。
　　G13結(jié)構(gòu)域具有抑制細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)繁殖的活性,但對(duì)動(dòng)物細(xì)胞和脂質(zhì)體沒有影響。目前藥物多肽主要通過化學(xué)方法合成和基因工程方法生產(chǎn)。由于化學(xué)方法合成多肽成本較高,所以本研究使 G13結(jié)構(gòu)

2、域在大腸桿菌中表達(dá),得到有活性的重組顆粒裂解肽G13結(jié)構(gòu)域,從而為G13殺菌機(jī)理的研究和開發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)方法奠定基礎(chǔ)。
　　本研究根據(jù)已報(bào)道的G13結(jié)構(gòu)域氨基酸序列以及大腸桿菌密碼子的偏好性化學(xué)合成了G13結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的編碼區(qū)的有意義鏈。以合成的序列為模板、用相應(yīng)的特異性引物PCR擴(kuò)增 G13結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)。將 PCR產(chǎn)物直接克隆到pBAD/TOPO ThioFusion表達(dá)載體上,經(jīng)過菌液PCR初步鑒定,篩選出陽性重組子,序列分析

3、表明目的基因已克隆到T載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,并在基因工程菌株培養(yǎng)過程中加入誘導(dǎo)劑阿拉伯糖,在誘導(dǎo)時(shí)間為0h、2h、4h和5h條件下收集適量菌液,檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE分析表明在約15kD處出現(xiàn)一特異性條帶,而對(duì)照菌沒有出現(xiàn)這條帶,但蛋白表達(dá)量很低。同時(shí)監(jiān)測(cè)了基因工程菌株在加入誘導(dǎo)劑前后OD600值的變化,發(fā)現(xiàn)隨著外源蛋白的表達(dá),菌液OD600值下降,但隨后又緩慢上升,將上升后的菌液提取

4、質(zhì)粒后重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取單克隆,測(cè)序發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)的菌液中由于毒性蛋白表達(dá)帶來的選擇壓力,啟動(dòng)子發(fā)生了下降突變。
　　將引物的兩端加入Eco R I、Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)后,回收純化后的G13結(jié)構(gòu)域PCR產(chǎn)物,用Eco R I、Sal I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后連接到原核表達(dá)載體pThioHisA的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上。將重組過的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,加入 IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE