非典型性E2Fs在肝癌細(xì)胞分化中的作用研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子E2F家族參與調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、分化、衰老及多倍體化等重要生物學(xué)過程，與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。E2F家族成員根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為典型性和非典型性兩類，典型性的E2F成員E2F1-6，它們都含有與DP蛋白等作用的結(jié)構(gòu)域，受RB-E2F信號(hào)通路的調(diào)控;非典型性E2F成員E2F7、E2F8，它們不與DP蛋白等作用，僅含有兩個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不受RB的調(diào)控。
　　本文在課題組前期關(guān)于非典型性E2F家族成員在人類肝細(xì)

2、胞癌生長中作用的研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討非典型E2F家族成員E2F7和E2F8基因?qū)Ω伟┘?xì)胞分化的影響及相關(guān)分子機(jī)制。通過能夠體外富集腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞成球培養(yǎng)技術(shù)。我們觀察了E2F7和E2F8基因?qū)Ω伟┘?xì)胞Hep-3B、Huh-7成球培養(yǎng)條件下的克隆形成能力影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含E2F7、E2F8基因的腺病毒載體能夠顯著抑制Hep-3B細(xì)胞成球培養(yǎng)條件的克隆形成能力;相反，特異性干擾E2F8的腺病毒載體則能夠顯著促進(jìn)Hep-3B細(xì)胞成球

3、培養(yǎng)條件下的克隆形成能力。同時(shí)，我們通過定量PCR、Western blotting技術(shù)檢測了E2F7、E2F8基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)受到干擾時(shí)，NANOG、SOX2、OCT-4基因表達(dá)上升。當(dāng)E2F7、E2F8基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，相關(guān)干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)下降。這些結(jié)果說明了非典型性E2F家族成員在肝癌的分化中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步深入研究它們在肝癌分化中涉及的分子機(jī)制，我們研究了E2F7、E2F8基因與細(xì)胞分化相關(guān)的PcG復(fù)合物、Wnt通路之

4、間的關(guān)系。Western Blot檢測分析E2F7、E2F8在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)對PcG復(fù)合物中主要成員EZH2及其底物H3K27me3改變情況。結(jié)果顯示過表達(dá)E2F7、E2F8可以抑制EZH2及其底物H3K27me3的表達(dá)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示外源性的E2F7、E2F8可以與肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性的EZH2相互作用。此外，利用TOP/FOP報(bào)告基因檢測系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫熒光技術(shù)分析了E2F7、E2F8對Wnt信號(hào)通路活性、β-cat