豬肺泡巨噬細胞NRAMP1基因啟動子克隆及特異性表達的功能驗證.pdf

1、豬PAM是PRRSV感染的靶細胞。為使抗PRRSV的外源基因在靶細胞中高效、特異性表達，培育出豬的抗PRRS轉基因新品系，篩選豬PAM特異表達基因啟動子是非常重要的。真核生物基因在無轉錄因子時，RNA聚合酶自身不能啟動轉錄，故處于不表達狀態(tài)，只有當轉錄因子（蛋白質）結合在其識別的DNA序列上后，基因才開始表達。因此，對特異表達基因啟動子研究既包括啟動子區(qū)順式作用元件確定又包含轉錄因子調控作用。
　　 研究表明豬自然抗性相關巨噬細

2、胞蛋白1（Nramp1）基因mRNA在單核巨噬細胞和肺、脾組織中都可表達，但在巨噬細胞中表達量最高。本研究通過半定量RT-PCR方法進行組織表達譜分析，驗證了Nramp1基因為PAM特異表達基因。采用缺失表達載體，研究了Nramp1基因啟動子在豬肺泡巨噬細胞、脂肪前體細胞、成纖維細胞和腎細胞的表達活性，獲得具有特異性調控能力的核心啟動子區(qū)。方法如下:
　　 1. RACE技術確定Nramp1基因的轉錄起始位點
　　 Nr

3、amp1基因轉錄起始位點的確定為研究該基因的轉錄調控奠定了基礎。通過NCBI下載Nramp1基因mRNA序列，并設計5'RACE特異性引物。依據Smarter RACEkit克隆出Nramp1基因5'非翻譯區(qū)，確定其轉錄起始位點為A，位于ATG上游90bp處。GenBank登錄號為HM754433.
　　 2.Nramp1基因啟動子缺失表達載體構建
　　 首先，利用生物信息學方法查找豬Nramp1基因5'調控序列，同時預

4、測出啟動子及轉錄因子結合位點大概位置;其次，應用PCR技術擴增不同長度缺失片段的啟動子，分別連接到螢火蟲熒光素酶報告基因pGL3-Basic載體上，經酶切、測序鑒定成功構建了八種重組表達載體pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274、 pLUC179。
　　 3.缺失啟動子活性分析及細胞特異性驗證
　　 將螢火蟲熒光素酶重組表達載體與海腎熒光素酶報告

5、載體按照20∶1共轉染肺泡巨噬細胞，24小時后，通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，以pRL-TK熒光活性值為內對照，并將pGL3-Basic的基礎活性值定為1，分析缺失啟動子活性，篩選出核心啟動子區(qū)為pLUC487。同時瞬時轉染其他非巨噬細胞，如豬腎細胞、脂肪前體細胞、豬胎兒成纖維細胞。驗證該核心啟動子具有細胞特異性，同時篩選出與細胞特異表達相關的調控元件。
　　 通過生物信息學分析和實驗研究相結合，篩選出Nramp1基因