豬肺泡巨噬細(xì)胞NRAMP1基因啟動(dòng)子克隆及特異性表達(dá)的功能驗(yàn)證.pdf

1、豬PAM是PRRSV感染的靶細(xì)胞。為使抗PRRSV的外源基因在靶細(xì)胞中高效、特異性表達(dá)，培育出豬的抗PRRS轉(zhuǎn)基因新品系，篩選豬PAM特異表達(dá)基因啟動(dòng)子是非常重要的。真核生物基因在無轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，RNA聚合酶自身不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，故處于不表達(dá)狀態(tài)，只有當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子（蛋白質(zhì)）結(jié)合在其識別的DNA序列上后，基因才開始表達(dá)。因此，對特異表達(dá)基因啟動(dòng)子研究既包括啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件確定又包含轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作用。
　　 研究表明豬自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)

2、胞蛋白1（Nramp1）基因mRNA在單核巨噬細(xì)胞和肺、脾組織中都可表達(dá)，但在巨噬細(xì)胞中表達(dá)量最高。本研究通過半定量RT-PCR方法進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，驗(yàn)證了Nramp1基因?yàn)镻AM特異表達(dá)基因。采用缺失表達(dá)載體，研究了Nramp1基因啟動(dòng)子在豬肺泡巨噬細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腎細(xì)胞的表達(dá)活性，獲得具有特異性調(diào)控能力的核心啟動(dòng)子區(qū)。方法如下:
　　 1. RACE技術(shù)確定Nramp1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)
　　 Nr

3、amp1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定為研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。通過NCBI下載Nramp1基因mRNA序列，并設(shè)計(jì)5'RACE特異性引物。依據(jù)Smarter RACEkit克隆出Nramp1基因5'非翻譯區(qū)，確定其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為A，位于ATG上游90bp處。GenBank登錄號為HM754433.
　　 2.Nramp1基因啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體構(gòu)建
　　 首先，利用生物信息學(xué)方法查找豬Nramp1基因5'調(diào)控序列，同時(shí)預(yù)

4、測出啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)大概位置;其次，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增不同長度缺失片段的啟動(dòng)子，分別連接到螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因pGL3-Basic載體上，經(jīng)酶切、測序鑒定成功構(gòu)建了八種重組表達(dá)載體pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274、 pLUC179。
　　 3.缺失啟動(dòng)子活性分析及細(xì)胞特異性驗(yàn)證
　　 將螢火蟲熒光素酶重組表達(dá)載體與海腎熒光素酶報(bào)告

5、載體按照20∶1共轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細(xì)胞，24小時(shí)后，通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，以pRL-TK熒光活性值為內(nèi)對照，并將pGL3-Basic的基礎(chǔ)活性值定為1，分析缺失啟動(dòng)子活性，篩選出核心啟動(dòng)子區(qū)為pLUC487。同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染其他非巨噬細(xì)胞，如豬腎細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞、豬胎兒成纖維細(xì)胞。驗(yàn)證該核心啟動(dòng)子具有細(xì)胞特異性，同時(shí)篩選出與細(xì)胞特異表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件。
　　 通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合，篩選出Nramp1基因