HER2特異性CAR T細(xì)胞的制備及其對胃癌抑制作用的體外和體內(nèi)研究.pdf

1、研究背景：
　　胃癌是世界最常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康，尤其是晚期胃癌患者，目前仍缺乏有效治療手段可以顯著提高生存時間。近年來，以放化療為主的傳統(tǒng)療法因復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)嚴(yán)重等缺點(diǎn)而屢遭詬病，隨著生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，具有腫瘤特異性殺傷效果的靶向治療逐漸成為國際研究熱點(diǎn)。
　　嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)T細(xì)胞免疫治療屬于細(xì)胞靶向治療方式之一，即通過病毒等載體將可識別特定抗原的

2、CAR基因轉(zhuǎn)染并表達(dá)于T細(xì)胞，體外擴(kuò)增后回輸入患者體內(nèi)引起特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。CAR分子主要由胞外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)四部分組成。為增強(qiáng)CART細(xì)胞增殖活化能力，研究者不斷增加信號傳導(dǎo)區(qū)內(nèi)共刺激分子的數(shù)量，發(fā)展出新一代CART細(xì)胞，大大提高了T細(xì)胞抗腫瘤能力。該療法具有高特異性和非主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性等優(yōu)點(diǎn)，并在血液惡性腫瘤的治療中

3、獲得顯著的臨床效果，然而其在實(shí)體瘤的臨床應(yīng)用中受到很大挑戰(zhàn)，主要包括嚴(yán)重不良事件的發(fā)生，腫瘤免疫抑制微環(huán)境，CAR-T細(xì)胞歸巢能力和局部活化能力差等問題。
　　人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)蛋白在胃癌患者中過表達(dá)，同時研究證明其對腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)亞群的生存和功能維持起到重要的作用。鑒于曲妥珠單抗在胃癌治療中的顯著

4、效果，表面抗原HER2可作為CART細(xì)胞治療的較理想靶點(diǎn)。
　　研究目的：
　　在這項(xiàng)研究中，我們以HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一種新穎的HER2特異性CAR分子，經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，觀察CAR基因修飾T細(xì)胞的表型特征，并評估CART細(xì)胞對胃癌細(xì)胞和胃癌干樣細(xì)胞的體內(nèi)和體外殺傷能力。
　　研究方法：
　　1、通過慢病毒載體將CAR受體的HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ

5、基因轉(zhuǎn)染入T細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞儀檢測CAR T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和表型特征。
　　2、體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測HER2表達(dá)情況，并通過慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)卡RNA(shRNA)基因沉默技術(shù)敲低胃癌細(xì)胞HER2表達(dá)。
　　3、細(xì)胞因子ELISA法檢測CART-HER2細(xì)胞在體外對胃癌細(xì)胞的特異性活化能力，LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測CART-HER2細(xì)胞在體外對胃癌細(xì)胞的特異性殺傷能力。
　　4、培養(yǎng)原代胃癌細(xì)胞，利用腫瘤細(xì)胞

6、成球?qū)嶒?yàn)獲得胃癌干樣細(xì)胞，并通過CART細(xì)胞與胃癌細(xì)胞球共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評估CART細(xì)胞對胃癌干樣細(xì)胞的殺傷能力。
　　5、利用HER2陽性胃癌細(xì)胞和胃癌干樣細(xì)胞建立BALB/C裸鼠胃癌模型。
　　6、通過測量小鼠移植瘤的體積和重量評估CART細(xì)胞體內(nèi)胃癌腫瘤抑制能力。
　　7、通過小鼠外周血和腫瘤內(nèi)CAR基因拷貝量檢測和病理組織免疫組化染色評估CART細(xì)胞的體內(nèi)持續(xù)和歸巢能力。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功將C

7、AR受體的HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ基因轉(zhuǎn)染入T細(xì)胞，轉(zhuǎn)柒效率為34.22％±4.00％，體外擴(kuò)增后，CAR T細(xì)胞CD8+CD56-表型比例為72.55％±7.26％，中央記憶表型CD45RO+CD62L+CCR7+比例為23.35％±7.59％。
　　2、胃癌細(xì)胞系HER2陽性率為84.39％～98.60％，兩株原代胃癌細(xì)胞HER陽性率分別為56.80％和2.48％，N87-HER2KD細(xì)胞和7901-HE

8、R2KD細(xì)胞HER2陽性率分別為41.01％和56.00％。
　　3、CART-HER2細(xì)胞與HER2陽性胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，釋放的白介素2、干擾素-γ、白介素4、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子、腫瘤壞死因子、顆粒酶B等細(xì)胞因子水平顯著高于對照組，對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率也明顯優(yōu)于對照組。
　　4、成功培養(yǎng)出胃癌干細(xì)胞球，HER2和CD44陽性率分別為73.5％和98.6％。CAR T細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞球共培養(yǎng)48小時后，腫瘤球被分解成小片

9、，大量腫瘤干樣細(xì)胞死亡裂解，殺傷效果顯著高于對照組。
　　5、通過皮下注射HER2陽性胃癌細(xì)胞或胃癌干樣細(xì)胞成功建立胃癌BALB/C裸鼠模型。
　　6、CART-HER2細(xì)胞治療組小鼠腫瘤生長速率明顯受到抑制，腫瘤平均體積和平均質(zhì)量顯著低于NTT細(xì)胞治療組。
　　7、治療3周后，小鼠外周血和腫瘤內(nèi)CAR基因平均拷貝量處于高水平狀態(tài)，而至少56天內(nèi)，小鼠外周血CAR基因拷貝量處于可檢測水平。免疫組化染色提示大量人CD3陽

10、性T細(xì)胞浸潤腫瘤組織，明顯高于對照組。
　　研究結(jié)論：
　　1、攜帶HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ基因的慢病毒成功合成，病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后，CAR蛋白能夠穩(wěn)定表達(dá)于T細(xì)胞表面。
　　2、CART-HER2細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，細(xì)胞大量增殖，其中絕大部分細(xì)胞為CD8+效應(yīng)T細(xì)胞，同時中央記憶型T細(xì)胞比例也明顯提高。
　　3、CART-HER2細(xì)胞在體外能夠被HER2陽性胃癌細(xì)胞特異性激活，分泌大量細(xì)胞因子

11、，并能有效地裂解多種HER2陽性的胃癌細(xì)胞以及胃癌患者來源的原代細(xì)胞。
　　4、CART-HER2細(xì)胞可以有效、持續(xù)、靶向定位地抑制HER2陽性胃癌BALB/c裸鼠模型的生長。
　　5、CART-HER2細(xì)胞在體外能夠明顯抑制HER2陽性胃癌干細(xì)胞球的生長，并能有效識別并裂解患者來源的HER2陽性胃癌干樣細(xì)胞。
　　6、HER2陽性胃癌干樣細(xì)胞可以在BALB/c裸鼠皮下成瘤，而CART-HER2細(xì)胞有效抑制了移植瘤在裸