低氧條件下HIF-1α與ROCK1的相互作用對(duì)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞增殖及膠原合成影響的研究.pdf

1、背景：
　　肝纖維化嚴(yán)重影響人體的健康，其中肝星狀細(xì)胞（HSCs）的活化扮演著至關(guān)重要的角色。活化的肝星狀細(xì)胞分泌膠原等成分，引起細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，進(jìn)而引起肝纖維化。目前治療肝纖維化主要集中在抑制HSCs增殖并阻止它的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。近年來，國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為低氧在肝纖維化中起到關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞暴露于低氧時(shí)可誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的產(chǎn)生。Rho相關(guān)含卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCK1）與 HIF-1α之間的關(guān)系密切，

2、多種疾病中兩者存在緊密聯(lián)系。
　　目的：
　　旨在分析 HSCs于低氧下增殖和膠原合成過程中，是否存在 HIF-1α和ROCK1的聯(lián)系，進(jìn)一步加深對(duì)肝纖維化形成和發(fā)展具體機(jī)制的理解，以期找到治療肝纖維新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　以大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6為模型。先在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè) I型膠原和 III型膠原分泌的水平，并用蛋白印跡技術(shù)（westernblot）和免疫熒光染色技術(shù)分析α-平滑肌

3、肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)水平，同時(shí)用westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-PCR）檢測(cè)HIF-1α和ROCK1的表達(dá)水平。接著設(shè)置常氧對(duì)照組與低氧實(shí)驗(yàn)組，通過向肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA降低HIF-1α的表達(dá)，用westernblot和RT-PCR檢測(cè)α-SMA和I型膠原的水平，Elisa檢測(cè)細(xì)胞上清中III型膠原的濃度。下一步，分組向細(xì)胞中加入 ROCK1特異性抑制劑降低 ROCK1表達(dá)，分析常氧情況下和低氧情況下，

4、α-SMA、I型膠原的水平以及III型膠原的變化程度。最后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染對(duì)照組，轉(zhuǎn)染siHIF-1α組和ROCK1抑制劑組，用MTT試驗(yàn)測(cè)試低氧條件下細(xì)胞的增值情況。
　　結(jié)果：
　　低氧條件下培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞，在0h，12h，48h檢測(cè)I型膠原、III型膠原表達(dá)逐漸上升，也發(fā)現(xiàn)α-SMA表達(dá)升高，同時(shí)HIF-1α和ROCK1隨著時(shí)間延長(zhǎng)其水平也呈現(xiàn)提高。在低氧下，轉(zhuǎn)染HIF-1α后，α-SMA和I型膠原表達(dá)受到

5、抑制，降低了III型膠原分泌，并且ROCK1的蛋白和mRNA水平也出現(xiàn)下調(diào)。HSC-T6細(xì)胞中加入ROCK1特異性抑制劑，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性降低，α-SMA和I型膠原表達(dá)程度下調(diào)，III型膠原分泌減少，而且HIF-1α的蛋白和mRNA也明顯抑制。最后，發(fā)現(xiàn)降低HIF-1α水平和加入ROCK1抑制劑后，降低了細(xì)胞的增值。
　　結(jié)論：
　　研究發(fā)現(xiàn)低氧條件下，大鼠肝星狀細(xì)胞增值和膠原合成過程中HIF-1α和ROCK1的聯(lián)系發(fā)揮著重要的