液相色譜法對不同狀態(tài)蛋白的快速分離和鑒定.pdf

1、基因重組蛋白的復性問題是生物工程下游技術(shù)中的一個瓶頸。對于蛋白復性過程中所形成的中間體(M state)的研究是解決促進蛋白進行正確折疊的關(guān)鍵。蛋白折疊色譜是近年來出現(xiàn)的一個新的復性方法，它不僅可以實現(xiàn)蛋白折疊過程中不同分子構(gòu)象狀態(tài)的分離，而且該方法也可用于研究蛋白的分子構(gòu)象變化，并用計量置換理論(stoichiometric displacement theory，SDT)中的兩個線性參數(shù)z和log/對蛋白變性及復性過程中產(chǎn)生的不同分

2、子構(gòu)象狀態(tài)其進行表征，所以用蛋白質(zhì)折疊液相色譜法和SDT來對蛋白折疊及折疊中間體進行研究是當前生物技術(shù)中的一個新方法。二維及多維液相色譜法已成為分析化學中復雜體系組分分離和分析的強有力工具，尤其在蛋白質(zhì)組學研究中對整體(intact)天然蛋白(N態(tài))的預分離方面。由于傳統(tǒng)的二維及多維液相色譜本身存在的一些缺陷而限制了其在蛋白質(zhì)組學研究方面的廣泛應用，因此對二維液相色譜方法的改進及發(fā)展目前仍為國內(nèi)外蛋白組學及色譜研究的熱點之一。

3、論文包括以下5個部分： 1.文獻綜述：蛋白折疊過程中產(chǎn)生的中間體在很大程度上阻礙了變性蛋白(U態(tài))向具有生物活性的天然態(tài)的轉(zhuǎn)變，而且由于中間體的壽命非常短使得難以對其進行分離和捕獲，因此對蛋白折疊及折疊中間體的研究具有重大的理論意義和重要的實際價值，目前的研究還一直處于經(jīng)驗摸索的階段。本文從蛋白折疊及折疊中間體形成的原因、研究策略、方法及進展進行了全面地綜述。在二維液相色譜(tWO dimensional liquid chro

4、matography,2DLC)方面，全面介紹了目前二維及多維液相色譜(MDLC)發(fā)展的方向以及存在的問題，共包括文獻160篇。 2.用疏水相互作用色譜法對脲變 -糜蛋白酶(a-Chy)折疊中間體進行了研究，通過HIC在動態(tài)條件下在線制備和純化出一個穩(wěn)定的a-Chy中間體。在不同的脲變條件下測定了天然和中間體a-Chy的Z、lgI和j值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當脲濃度不同時，天然和中間體a-Chy與固定相表面的這三個不同參數(shù)有很大區(qū)別，其中

5、天然a-Chy的z和lgI之間有很好的線性關(guān)系，而中間體卻沒有，并且中間體的Z和lgI值要比天然態(tài)的小得多，根據(jù)這三個參數(shù)的不同可以用來區(qū)分蛋白的不同分子構(gòu)象狀態(tài)，建立了一個在線折疊液相色譜表征a-Chy中間體的新方法。 3.以脲變 - 糜蛋白酶(a-Chy)為模型蛋白，用蛋白折疊液相色譜法研究了該蛋白在6種不同固體表面上的折疊及其在折疊過程中形成的中間體，選用疏水相互作用色譜(HPHIC)固定相為吸附劑，在動態(tài)條件下著重研究

6、了疏水色譜固定相TSK和PEG-600表面對脲變a-Chy復性效率的貢獻。用基質(zhì)輔助激光解吸附離子化飛行時間質(zhì)譜對3.0 mol/L，脲變a-Chy，在經(jīng)HPHIC柱復性并同時分離的收集組分進行確認后，僅有一種穩(wěn)定的脲變a-Chy折疊中間體。并通過活性測定發(fā)現(xiàn)該折疊中間體難以復性并具有低的生物活性，但PEG-600固定相表面較TSK固定相對a-Chy復性效果好。證實了疏水性強度及固體表面配基的結(jié)構(gòu)對蛋白折疊起著關(guān)鍵性的作用。 4

7、.通過實驗合成了三種具有弱陽('WCX)和疏水(}tIC)性質(zhì)的雙功能色譜固定相(bi-functional stationary phase)，通過對這幾種固定相的表征發(fā)現(xiàn)該雙功能固定相無論在IEC模式下還是在HIC模式下對蛋白都有很高的分辨率，因此這種色譜柱稱之為WCX-HIC柱，并簡要描述了WCX-HIC柱對蛋白的分離原理。蛋白在IEC和HIC的保留強弱可以根據(jù)配基的種類，加入的量以及合成條件的不同進行控制。實驗測得該類型的雙功能

8、色譜固定相在兩種模式下都具有很大的動力學吸附量，而且通過對標準蛋白的質(zhì)量回收率測定發(fā)現(xiàn)，這幾種標準蛋白分別在這兩種模式下的質(zhì)量回收率都大于96％，表明該類型的固定相對蛋白的不可逆吸附很小。在此基礎(chǔ)上首次提出了用一根色譜柱來實現(xiàn)離子交換和疏水色譜快速分離整體蛋白的新方法。在選擇合適的固定相、流動相、緩沖液交換方法及二次進樣的條件下，在1小時內(nèi)用同一根色譜柱完成了通常用兩根色譜柱和在兩種流動相條件才能實現(xiàn)的“二維色譜”分離，并且能維持蛋白原

9、有的三維和四維分子結(jié)構(gòu)。通過和最好的商品TSK離子交換和疏水色譜柱比較發(fā)現(xiàn)，本實驗合成的雙功能固定相在單獨的IEC和HIC模式下可以和TSK柱相媲美。而且從峰容量來看，由于雙功能色譜柱可以用于二維色譜分離，因此在IEC～HIC或HIC～IEC的二維色譜模式下其峰容量(n1×n2)大大超過一根色譜柱，比如TSK柱。 5.首次將合成的雙功能色譜柱用于特殊模式的2DLC蛋白分離，即蛋白單柱二維液相色譜法(two-dimensional

10、 LC by a single column，2DLC-1C)。該2DLC-1C既可以在離線，也可以在在線模式下對蛋白進行分離，后者稱之為在線2DL-1C。通過解決在線緩沖液的快速交換，實現(xiàn)了大體積的樣品或收集液(0.001～100mL)進行連續(xù)或非連續(xù)的在線進樣。首次將2DLC-1C用于分析和制備規(guī)模上的在線蛋白二維分離。通過離線和在線模式下實驗了對標準蛋白的二維分離以及對實際樣品人血清的快速預分離，取得了非常滿意的效果。這種2DLC

11、.1C的優(yōu)點有：(1)整個蛋白分離都是在密封的體系中進行的，從而防止了樣品的污染；(2)所有的樣品組分都是定量地轉(zhuǎn)移到下一步的操作；(3)所有的蛋白都保持其天然狀態(tài)；(4)原樣的復雜性大大簡化，比如1/10～1/100，甚至更??；(5)每一種蛋白的相對豐度，尤其蛋白質(zhì)組學中可以提高低豐度蛋白的濃度10～100倍，甚至更高；(6)容易實現(xiàn)操作自動化；(7)可以在線進行天然或整體蛋白的快速分離：(8)該方法不但可以提高信息的可靠性，而且可以