溫陽活血利水法對嘌呤霉素損傷足細胞的細胞骨架及相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：觀察溫陽活血利水方含藥血清對嘌呤霉素損傷小鼠永生系足細胞組織蛋白酶L（Cathepsin L,CatL）的轉(zhuǎn)錄因子Dendrin、膜相關(guān)鳥苷酸激酶轉(zhuǎn)化蛋白2(Membrane-associated guanylate kinase inverted2,MAGI-2）、下游底物synaptopodin、RhoA的表達變化以及足細胞骨架蛋白actin、中間絲分布情況的影響，探討溫陽活血利水方的作用改善腎病綜合征蛋白尿及足突融合的機制。

2、
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠永生系足細胞MPC5，采用嘌呤霉素45mg/L損傷足細胞12h后分組，并設(shè)正常對照、中藥血清空白對照，具體分組如下：A.正常對照組、B.模型組、C.中藥血清空白對照組、D.地塞米松（1umol/l）組、E.10％中藥血清組、F.20%中藥血清組，孵育12小時，熒光定量 PCR檢測Synaptopodin、CatL mRNA表達變化；western blotting測定MAGI-2、Synaptopodin、

3、CatL、RhoA的蛋白表達；細胞免疫熒光觀察 Dendrin、MAGI-2、Synaptopodin、CatL、RhoA的表達與分布；通過異硫氰酸熒光素(FITC）-鬼筆毒環(huán)肽(phalloidin）染色標記足細胞骨架結(jié)構(gòu)微絲（F-actin），觀察微絲熒光表達及結(jié)構(gòu)變化；通過vimentin染色標記足細胞骨架結(jié)構(gòu)中間絲，觀察中間絲的熒光表達及結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：1.嘌呤霉素作用足細胞12h后，CatL mRNA表達明顯增加（

4、與正常對照比較P＜0.01）,Synaptopodin mRNA表達沒有明顯變化（與正常對照比較P＞0.05）；地塞米松、10%與20%含藥血清干預(yù)后CatL mRNA表達減少（與模型組比較P＜0.01）,20%含藥血清組CatL mRNA水平低于10%含藥血清組（P＜0.01），各治療組Synaptopodin mRNA表達沒有變化（與模型組比較，均P＞0.05）。
　　2.嘌呤霉素作用于足細胞12h后，MAGI-2、RhoA、

5、Synaptopodin蛋白的表達顯著性下降（與正常組對比，均P＜0.01），CatL蛋白的表達顯著性升高（與正常組對比，P＜0.01）；地塞米松、10%及20%的中藥血清干預(yù)后，MAGI-2、RhoA、Synaptopodin蛋白的表達有所增多(與模型組對比,均P＜0.01），CatL蛋白的表達有所降低(與模型組對比,P＜0.01），但未達到正常水平（MAGI-2、RhoA、Synaptopodin、CatL蛋白與正常組對比，均 P＜

6、0.01）。20%中藥血清組 MAGI-2、RhoA、Synaptopodin蛋白水平高于10%中藥血清組(均P＜0.01），20%中藥血清組CatL蛋白水平低于10%中藥血清組(P＜0.01）。
　　3.免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡下可見模型組中 Dendrin轉(zhuǎn)核比例增多（與正常組對比P＜0.01）;地塞米松、10%中藥血清及20%中藥血清與足細胞共孵育后Dendrin轉(zhuǎn)核比例減少（與模型組對比，均P＜0.01），但未達到正常

7、（與正常組對比，均P＜0.01）;地塞米松組與10%和20%中藥血清組比較dendrin轉(zhuǎn)核比例沒有顯著差異（均P＞0.05），而20%中藥血清組中dendrin轉(zhuǎn)核比例少于10%中藥血清組（P＜0.01）。
　　4.免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡下觀察微絲、中間絲，可見正常足細胞中間絲和微絲結(jié)構(gòu)清晰，排列有序，可見伸展的偽足。嘌呤霉素損傷足細胞12h后，模型組中足細胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，偽突回縮變短，細胞呈圓形或橢圓形，中間絲和微絲結(jié)

8、構(gòu)紊亂，雜亂無章排列，結(jié)構(gòu)不清晰；地塞米松組、10%和20%中藥血清組中細胞骨架結(jié)構(gòu)微絲、中間絲較模型組有所恢復(fù)，排列稍有序，出現(xiàn)偽突結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：足細胞經(jīng)嘌呤霉素損傷后出現(xiàn) MAGI-2表達下降，Dendrin核內(nèi)轉(zhuǎn)移，足細胞胞質(zhì) CatL水平的增加，同時胞質(zhì) CatL的底物蛋白synaptopodin表達減少，但synaptopodin蛋白的mRNA表達并沒有變化，提示 synaptopodin水平減少不是在轉(zhuǎn)錄水平，而是