環(huán)氧合酶-2基因敲低對(duì)嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分環(huán)氧合酶-2基因敲低對(duì)足細(xì)胞凋亡及 nephrin蛋白表達(dá)的影響
　　目的：研究發(fā)現(xiàn)嘌呤氨基核苷可以誘導(dǎo)條件永生性小鼠足細(xì)胞凋亡，其中 COX-2的表達(dá)增加，使用特異性COX-2抑制劑塞來昔布可使足細(xì)胞凋亡減輕。但塞來昔布抑制足細(xì)胞凋亡可能并不完全依賴對(duì)COX-2的調(diào)節(jié)。為了證明足細(xì)胞 COX-2表達(dá)降低是塞來昔布抑制凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)增加COX-2特異性小干擾RNA（small interfere RNA，siRNA）實(shí)

2、驗(yàn)，將足細(xì)胞COX-2基因敲低，探討COX-2表達(dá)降低對(duì)足細(xì)胞凋亡及nephrin蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：以條件永生性小鼠足細(xì)胞株為研究對(duì)象：分為正常對(duì)照組、5μl的siRNA組、10μl的siRNA組、15μl的siRNA組。經(jīng)誘導(dǎo)分化成熟，在干擾48 h后用半定量RT-PCR和Western bolt分別檢測COX-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，用流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞凋亡水平。2.以10μl的siRNA組作為研究對(duì)象，分別設(shè)

3、立足細(xì)胞正常對(duì)照組、足細(xì)胞COX-2基因敲低組和足細(xì)胞陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組，用Western bolt檢測nephrin蛋白、BAX蛋白及BCL-Xl蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1．與正常對(duì)照組比較，隨著干擾濃度的增加，COX-2mRNA及蛋白表達(dá)逐漸減少，而足細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，15μl的siRNA組凋亡率明顯增高。2．10μl COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染組 nephrin蛋白表達(dá)顯著低于陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。3.與陰性轉(zhuǎn)染組

4、相比，10μl COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染組Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而Bcl-xl蛋白表達(dá)稍有下調(diào)。
　　結(jié)論：1.敲低COX-2的基因表達(dá)可以導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，并隨著干擾濃度的增加，足細(xì)胞凋亡率逐漸增加。2.在干擾濃度為10μl時(shí)，足細(xì)胞nephrin蛋白的表達(dá)下調(diào)，3.而BAX蛋白上調(diào)及BCL-Xl蛋白下調(diào)參與了足細(xì)胞的凋亡。
　　第二部分環(huán)氧合酶-2基因敲低對(duì)嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：我們在

5、前期試驗(yàn)中采用體外培養(yǎng)的條件永生性小鼠足細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡過程中COX-2的表達(dá)隨時(shí)間延長是逐漸增多，而特異性COX-2抑制劑塞來昔布則可以減少PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，推測塞來昔布抑制足細(xì)胞凋亡的作用可能是通過抑制COX-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但塞來昔布抑制凋亡可能并不完全依賴對(duì)COX-2的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用COX-2 siRNA干擾技術(shù)將實(shí)驗(yàn)中足細(xì)胞COX-2基因敲低，觀察嘌呤霉素氨基核苷

6、誘導(dǎo)凋亡的小鼠足細(xì)胞中COX-2的表達(dá)水平及足細(xì)胞nephrin及CD-2AP的表達(dá)，進(jìn)一步研究足細(xì)胞COX-2基因敲低對(duì)足細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制。
　　方法：以條件永生化小鼠足細(xì)胞株為研究對(duì)象，分組如下：1.足細(xì)胞對(duì)照組(A組)、2.足細(xì)胞嘌呤霉素氨基核苷組(B組)、3.足細(xì)胞嘌呤霉素氨基核苷+塞來昔布組(C組)、4.足細(xì)胞塞來昔布組(D組)、5.足細(xì)胞陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組(E組)、6.足細(xì)胞COX-2基因敲低組(F組)、7.足細(xì)胞COX

7、-2基因敲低+嘌呤霉素氨基核苷組(G組)、8.足細(xì)胞COX-2基因敲低+塞來昔布組(H組)，MTT法及流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡百分率，用Western bolt檢測各組細(xì)胞COX2、Nephrin、CD2AP蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.與A組比較，B組COX-2表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞凋亡百分率明顯增加，Nephrin、CD2AP蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，C組細(xì)胞凋亡百分率較B組低；2. F組及G組兩組足細(xì)胞凋亡百分率較E組高，G組細(xì)胞凋