環(huán)氧合酶-2基因敲低對嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中COX-2及podocin蛋白表達的影響.pdf

1、目的：
　　 采用環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)小干擾RNA(smallinterfereRNA,siRNA)基因重組技術(shù),將足細(xì)胞(podocyte)COX-2基因敲低(knockdown),觀察對足細(xì)胞凋亡的影響,并進一步研究嘌呤霉素氨基核苷(Puromycinaminonucleoside,PA)對COX-2基因敲低的足細(xì)胞凋亡的影響,以及對COX-2和Podocin蛋白表達的影響。
　

2、　 方法：
　　 1.將體外培養(yǎng)的條件永生性小鼠足細(xì)胞復(fù)蘇并傳代培養(yǎng),經(jīng)誘導(dǎo)分化成熟,并用不同濃度的COX-2siRNA將COX-2基因敲低,在干擾48h后用半定量RT-PCR和免疫蛋白印跡分別檢測COX-2mRNA表達水平及COX-2蛋白表達水平,用流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞凋亡水平。
　　 2.以條件永生性小鼠足細(xì)胞作為研究對象,實驗分為4組:(1)足細(xì)胞陰性轉(zhuǎn)染組(NS);(2)足細(xì)胞COX-2基因敲低組(COX-2s

3、igNA);(3)嘌呤霉素氨基核苷組(PA);(4)足細(xì)胞COX-2基因敲低+嘌呤霉素氨基核苷組(COX-2siRNA+PA)。根據(jù)實驗分組,COX-2siRNA組加入10μl濃度為10μM的siRNA,轉(zhuǎn)染2d后PA組加入100μg/ml嘌呤霉素氨基核苷(PA),培養(yǎng)24h,采用MTT法檢測各組細(xì)胞的凋亡情況,并用WesternBlot技術(shù)檢測各組足細(xì)胞的COX-2、Podocin蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.與

4、正常對照組比較,隨著干擾濃度的增加,COX-2mRNA及蛋白表達逐漸減少(P＜0.05),而足細(xì)胞的凋亡率逐漸升高,15μl的siRNA組凋亡率明顯增高(P＜0.05)。
　　 2.與陰性轉(zhuǎn)染組比較,PA組細(xì)胞COX-2表達明顯增多(P＜0.05);COX-2siRNA組細(xì)胞COX-2表達與陰性轉(zhuǎn)染組相比,表達顯著減少(P＜0.05);COX-2siRNA+PA組與PA組比較COX-2表達明顯減少(P＜0.05)。
　　

5、 3.與陰性轉(zhuǎn)染組比較,PA組足細(xì)胞24h生長抑制率明顯增加,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);COX-2siRNA+PA組足細(xì)胞24h生長抑制率與PA組相比明顯減少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.與陰性轉(zhuǎn)染組及COX-2siRNA組比較,PA組及COX-2siRNA+PA組細(xì)胞podocin表達明顯減少(P＜0.05);COX-2siRNA組細(xì)胞與陰性轉(zhuǎn)染組相比podocin表達明顯減少(P＜0.05);COX-2si

6、RNA+PA組細(xì)胞podocin表達與PA組比較,無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.足細(xì)胞COX-2基因敲低可以導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡,并隨著干擾濃度的增加,足細(xì)胞凋亡率逐漸增加。
　　 2.將足細(xì)胞COX-2基因敲低,在PA誘導(dǎo)下的足細(xì)胞COX-2表達明顯減少,同時其凋亡也減輕,表明減少足細(xì)胞中COX-2的表達與足細(xì)胞保護作用機制有一定相關(guān)性。
　　 3.足細(xì)胞COX-2基因敲低使podoc