HNF6對結(jié)腸癌腫瘤細胞生物學(xué)行為影響的初步研究.pdf

1、[研究背景]
　　 結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年提高。大規(guī)模人群普查資料表明，結(jié)直腸癌已成為我國發(fā)病率位居第四的常見惡性腫瘤。結(jié)直腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因，其中肝臟是最常見的遠處轉(zhuǎn)移器官。一旦發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌患者往往預(yù)后較差。目前臨床上應(yīng)用的免疫組化標(biāo)記不能很好的區(qū)分高轉(zhuǎn)移風(fēng)險的患者，因此從分子水平研究結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移機制，摸清轉(zhuǎn)移規(guī)律并從中找到預(yù)測和臨床治療靶點從而進行早期干預(yù)和治療成了刻

2、不容緩且意義重大的工作。
　　 腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的過程，只有高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞才能最終形成遠處轉(zhuǎn)移灶。通過裸鼠原位移植腫瘤可以最好的模擬人體內(nèi)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程，是研究結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移機制的重要載體。前期研究中，我們課題組通過裸鼠盲腸原位接種法構(gòu)建了肝轉(zhuǎn)移動物模型，并建立了一株肝轉(zhuǎn)移細胞系SW620M，通過親代細胞基因表達對比，我們發(fā)現(xiàn)肝細胞核因子(HNF6)在SW620M表達升高。并且HNF6的表達在SW620M細胞體外培養(yǎng)一

3、段時間后恢復(fù)到原來水平，提示結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶中HNF6的表達與肝臟特異的微環(huán)境相關(guān)。
　　 HNF6屬于在肝細胞富集表達的轉(zhuǎn)錄因子家族，主要表達與肝臟和胰腺，人類HNF6定位于15q21.1-q21.2，編碼465個氨基酸的蛋白質(zhì)，主要參與胚胎期胰腺形成，肝細胞發(fā)育、膽道系統(tǒng)形成、能量代謝等過程。作為基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)HNF6調(diào)控NEUROG3、FOXM1、PDX1、HNF1、FOXA1、FOXA2等靶基因的轉(zhuǎn)錄。

4、其中多數(shù)靶基因為轉(zhuǎn)錄因子并已發(fā)現(xiàn)參與惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。PrévotPP等發(fā)現(xiàn)HNF6在胰腺管狀腺癌早期的腺泡一導(dǎo)管化生過程中過表達，提示HNF6與胰腺管狀腺癌早期癌變相關(guān)。LehnerF等通過免疫組化法對比結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶與肝轉(zhuǎn)移灶的蛋白表達發(fā)現(xiàn)：在肝轉(zhuǎn)移中HNF6和他的靶基因FOXA2、CXCL1、CXCL2等表達升高。然而HNF6在結(jié)直腸癌腫瘤細胞增殖，侵襲轉(zhuǎn)移等過程中的生物功能及機制尚未見報道。
　　 本研究旨在通過構(gòu)建

5、HNF6的慢病毒表達載體，建立慢病毒介導(dǎo)的HNF6過表達細胞系，初步研究HNF6對結(jié)腸癌細胞系SW620細胞生物學(xué)行為的影響，為下一步機制研究及在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 [研究目的]
　　 構(gòu)建HNF6的重組慢病毒表達載體，生產(chǎn)慢病毒顆粒并建立穩(wěn)定表達HNF6的結(jié)腸癌細胞SW620-HNF6。研究穩(wěn)定表達HNF6后，SW620細胞形態(tài)、遷移能力、增殖能力、克隆形成能力、體內(nèi)致瘤能力等生物學(xué)行為的變

6、化。
　　 [研究方法]
　　 1.利用pUC57-HNF6為模板，根據(jù)Genbank(NM_004498.1)中HNF6序列設(shè)計引物，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增CDS區(qū)利用基因重組技術(shù)連接到改造后的穿梭質(zhì)粒-pLenO-DCE-HA中。
　　 2.將pLenO-DCE-HA-HNF6與pRsv-REV，pMD1g-pRRE，pMD2G共轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞293T收集上清并測定病毒滴度。
　　 3.慢病毒

7、顆粒感染SW620細胞建立穩(wěn)定表達細胞系，westernblot法，RT-PCR法檢測HNF6表達情況。
　　 4.利用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，劃痕試驗及Transwell法觀察細胞遷移能力。
　　 5.繪制細胞生長曲線觀察HNF6對SW620細胞增殖能力的影響。平板克隆形成試驗觀察HNF6對SW620細胞克隆形成能力的影響。
　　 6.裸鼠成瘤試驗觀察穩(wěn)定表達HNF6后SW620細胞成瘤能力改變。
　

8、　 [研究結(jié)果]
　　 1.經(jīng)過PCR鑒定、酶切鑒定及測序成功構(gòu)建了pLenO-DCE-HA-HNF6重組慢病毒表達載體。
　　 2.利用293T細胞成功生產(chǎn)高滴度的慢病毒顆粒，滴度為5.1×108TU/ml。
　　 3.慢病毒顆粒感染SW620細胞72小時后熒光顯微鏡觀察到較強的GFP表達。經(jīng)過流式細胞檢測到實驗組SW620-HNF6與對照組SW620-EGFP的GFP表達率為82.3％和93.8％；細胞免疫

9、組化顯示HNF6高表達于細胞核，經(jīng)過Westernblot檢測HA-HNF6融合蛋白表達正確，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)mRNA水平上升高明顯。
　　 4.相差顯微鏡下觀察過表達HNF6后，SW620細胞形態(tài)由短梭形變?yōu)槎噙呅?，失去偽足并且生長更加緊密。Transwell試驗顯示過表達HNF6后轉(zhuǎn)移細胞數(shù)目由72.3±12.9下降到25.0±2.0,具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。劃痕試驗證明過表達HNF6后細胞遷移能力明顯降低。

10、r>　　 5.生長曲線顯示SW620-HNF6細胞增殖能力強于SW620-EGFP細胞，結(jié)果從第四天開始有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　 6.平板克隆形成試驗顯示SW620-HNF6和SW620-EGFP的克隆數(shù)分別為82.33±4.73和53.00±4.00,對應(yīng)克隆形成率為41.17％和26.5％，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 7.裸鼠成瘤試驗顯示，注射細胞5周后1×105的SW620-HNF6細胞可成瘤，而對應(yīng)細胞

11、數(shù)的對照細胞不能成瘤。1×106個細胞注射裸鼠24天后，SW620-HNF6細胞形成的腫瘤體積(1808±475.5mm3)明顯大于SW620-EGFP(789.9±266.3mm3)結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 我們成功了構(gòu)建pLenO-DCE-HA-HNF6重組慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞包裝后獲得高滴度的慢病毒顆粒。慢病毒可以高效的感染結(jié)腸癌SW620細胞并介導(dǎo)HNF6過表達。過表達