人胰腺癌腫瘤干細(xì)胞樣SP細(xì)胞的分離鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、胰腺癌是消化系統(tǒng)中預(yù)后最差的腫瘤之一，即使接受根治性切除術(shù)后的患者其5年生存率也只有5～10%。因而深入闡明胰腺癌發(fā)生機(jī)制，尋找胰腺癌治療的新靶點(diǎn)對(duì)于改善預(yù)后具有重要意義。最新研究認(rèn)為腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，是由少數(shù)具有成瘤能力的腫瘤干細(xì)胞增殖發(fā)育而成的異常組織。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志已在急性髓細(xì)胞樣白血病、乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中成功分離出相應(yīng)的腫瘤干細(xì)胞，并證明它們?cè)谀[瘤的形成和生長(zhǎng)過(guò)程中的決定

2、性作用。亦有學(xué)者從事胰腺癌干細(xì)胞的分離鑒定，但迄今尚未確定出公認(rèn)的表面標(biāo)志物。
　　 Li等通過(guò)鑒定提出CD44+CD24+ESA+的細(xì)胞亞群是胰腺癌干細(xì)胞，Hermann等認(rèn)為胰腺癌干細(xì)胞的表型是CD133+。另外，他們的研究主要是證明胰腺癌是由腫瘤干細(xì)胞形成的，調(diào)控其生長(zhǎng)增殖的信號(hào)通路尚未報(bào)道。腫瘤SP細(xì)胞的分離鑒別是被一致公認(rèn)的研究腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的替代方法。本研究采用流式分析證實(shí)了胰腺癌中SP細(xì)胞的存在，通過(guò)體內(nèi)體外

3、實(shí)驗(yàn)研究其包括干細(xì)胞特性在內(nèi)的生物學(xué)特性，并初步探討了PI3K/mTOR信號(hào)通路對(duì)其生存增殖的調(diào)控作用。
　　 第一部分：胰腺癌SP細(xì)胞的分離和表型分析
　　 目的：分離胰腺癌中的SP細(xì)胞亞群并確定其表型。
　　 方法：應(yīng)用Hoechst 33342染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)6個(gè)胰腺癌細(xì)胞系及3個(gè)原代培養(yǎng)的臨床胰腺癌標(biāo)本中SP細(xì)胞的含量。選取典型的具SP細(xì)胞的細(xì)胞系檢測(cè)SP細(xì)胞的表型。
　　 結(jié)果：除了BXPC

4、-3，其他胰腺癌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)標(biāo)本都存在Verapamil敏感的SP細(xì)胞。PANC-1、CAPAN-1、ASPC-1、PC-3和SW-1990中SP細(xì)胞的比例分別為7.84%,11.22%，16.88%，0.43%和2.25%。3個(gè)臨床標(biāo)本中SP細(xì)胞的比例分別為0.33%,2.79%和0.98%。PANC-1、CAPAN-1和ASPC-1中的絕大多數(shù)SP細(xì)胞的表型為CD133+和CD44+CD24-ESA+.
　　 結(jié)論：胰腺

5、癌中的確存在SP細(xì)胞，其表型為CD133+和 CD44+CD24-ESA+。
　　 第二部分：胰腺癌干細(xì)胞樣SP細(xì)胞生物學(xué)特性及化療耐藥機(jī)制初探
　　 目的：分離鑒定胰腺癌干細(xì)胞樣的SP細(xì)胞亞群并探討其生物學(xué)特性及化療耐藥機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用Hoechst 33342 染色，F(xiàn)ACS 分選胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中的SP細(xì)胞。通過(guò)平板克隆形成試驗(yàn)和NOD-SCID小鼠異種移植成瘤試驗(yàn)比較SP細(xì)胞與non-SP

6、細(xì)胞的克隆形成能力及成瘤能力，通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的SP細(xì)胞和SP細(xì)胞衍生腫瘤的Hoechst 33342復(fù)染SP再分析判斷其是否具有分化潛能。通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)評(píng)價(jià)SP細(xì)胞的自我更新能力。采用Transwell試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)比較分選的SP細(xì)胞與non-SP細(xì)胞的侵襲能力及其對(duì)化療藥物的耐藥性。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SP細(xì)胞與non-SP細(xì)胞中ABCB1和ABCG2的表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)比較SP細(xì)胞與non-SP細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　 結(jié)

7、果：PANC-1 SP細(xì)胞具有較高的自我更新能力和成瘤能力并且能夠發(fā)生不對(duì)稱分裂生成non-SP細(xì)胞。SP細(xì)胞的侵襲力及其對(duì)化療藥物的耐藥性明顯高于non-SP細(xì)胞。SP細(xì)胞中ABCB1和ABCG2的表達(dá)水平明顯高于non-SP細(xì)胞且大多數(shù)細(xì)胞處于G1期。
　　 結(jié)論：胰腺癌SP細(xì)胞富集了具有高侵襲能力的干細(xì)胞樣腫瘤起始細(xì)胞，其耐藥機(jī)制可能與其大多數(shù)細(xì)胞處于靜息期及某些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)相關(guān)。
　　 第三部分：PI3K

8、//mTOR信號(hào)通路參與胰腺腫瘤干細(xì)胞樣SP細(xì)胞生存增殖的調(diào)控
　　 目的：分離鑒定胰腺癌中腫瘤干細(xì)胞樣的SP細(xì)胞亞群并探討PI3K/mTOR信號(hào)通路對(duì)其生存與增殖的調(diào)控。
　　 方法：應(yīng)用流式分析檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中SP細(xì)胞的含量。觀察加入PI3K/mTOR信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002或雷帕霉素培養(yǎng)后PANC-1中SP細(xì)胞的含量變化。采用MTT試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)LY294002或雷帕霉素對(duì)分選的S

9、P細(xì)胞和non-SP細(xì)胞的抑制作用。
　　 結(jié)果：加入LY294002 或雷帕霉素培養(yǎng)后PANC-1 SP細(xì)胞的含量明顯降低（LY294002，7.60±0.27% vs 1.90±0.22%，P=0.000；雷帕霉素，7.60±0.27% vs 1.14±0.20%，P=0.000）。LY294002對(duì)SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞的生存抑制率（1-細(xì)胞存活率）分別是47.87±3.82%和27.64±2.09%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、（P=0.001）。雷帕霉素對(duì)SP細(xì)胞的生存抑制率亦高于non-SP細(xì)胞（57.04±2.78% vs 35.99±3.11%，P=0.001）。LY294002和雷帕霉素對(duì)SP細(xì)胞的克隆形成能力的抑制率也高于non-SP細(xì)胞（LY294002，54±6.56% vs 34.67±3.06%，P=0.01；雷帕霉素，48±3.61% vs 30.67±3.21%，P=0.003。
　　 結(jié)論：PI3K/mTOR信號(hào)通路參與對(duì)其生