新型人上皮性卵巢癌細胞HO8910靶向治療系統(tǒng)的構建及其生物學活性的體外研究.pdf

1、研究背景：目前，卵巢癌仍是致死率最高的婦科惡性腫瘤，5年生存率低于30％。臨床上一線治療卵巢癌的“金標準”是滿意的初次腫瘤細胞減滅術后給予紫杉醇+卡鉑方案聯(lián)合化療，盡管初次化療反應良好，但絕大多數(shù)患者易復發(fā)，且復發(fā)性卵巢癌大多數(shù)容易耐藥。卵巢癌患者的生存現(xiàn)狀十分嚴峻，探索手術、化療、放療之外新的治療方法顯得尤為重要。目前卵巢癌的生物靶向治療已取得不少研究成果，但臨床應用效果仍不理想，分子靶向藥物治療的靶向性差仍是需解決的問題。
　

2、　細胞穿膜肽(CPPs)聯(lián)合靶向治療將為腫瘤的治療開辟新途徑。轉錄反式激活因子(TAT)是一種高效的 CPPs，可攜帶大分子物質進人細胞并保證其生物活性。P38MAPK信號轉導通路在細胞周期調節(jié)及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。MKK6(E)是MKK6的活性突變體，它通過自發(fā)的激活P38MAPK信號轉導通路而介導凋亡。本課題組前期研究已采用全細胞差減法篩選出卵巢癌上皮細胞H08910特異性結合的7個氨基酸短肽SWQIGGN，命名為OSBP。本研

3、究擬將TAT攜帶小分子靶向肽及誘導腫瘤細胞凋亡的MKK6(E)，構建腫瘤藥物分子靶向殺滅系統(tǒng)，在卵巢癌治療方面國內外尚未有報道。
　　目的：本研究擬將TAT與H08910細胞株特異性結合短肽OSBP聯(lián)合，結合誘導腫瘤細胞凋亡的MKK6(E)，構建TAT-OSBP-MKK6(E)原核表達載體，獲得可溶性融合蛋白，并對其靶向輸送特性和體外活性進行研究鑒定，探索一種新型的腫瘤靶向穿膜藥物治療系統(tǒng)，為卵巢癌的有效治療提供新的可能。

4、　　方法：采用PGEX-6P-3質粒分別構建TAT-EGFP，OSBP-EGFP,TAT-OSBP-EGFP,TAT-OSBP和TAT-OSBP-MKK6(E)表達載體，重組質粒轉化BL21（DE3)大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導表達和GST SefinoseTMResin柱親和層析純化后，采用SDS-PAGE和Western blotting鑒定。流式細胞術分析不同濃度(0,1,5,10umol/L) TAT-EGFP,OSBP-EGFP和

5、TAT-OSBP-EGFP融合蛋白處理H08910細胞2h后的細胞穿膜率，細胞免疫熒光法及流式細胞學方法檢測三種融合蛋白對H08910的輸送特性，CCK-8法檢測0,1,5,10,15,40,60,80,100umol/L TAT-OSBP-EGFP處理H08910細胞2h后的細胞活性。通過細胞增殖及凋亡實驗了解融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對腫瘤細胞的抑制效果。
　　結果：
　　1.成功的構建TAT-EGFP，O

6、SBP-EGFP,TAT-OSBP-EGFP,TAT-OSBP-MKK6(E)和TAT-OSBP原核表達載體，并獲得各自相應的可溶性融合蛋白。
　　2.與 TAT-EGFP相比，當濃度為10umol/L時，TAT-OSBP-EGFP處理后H08910細胞的穿膜率無明顯升高;但當濃度1,5umol/L時，TAT-OSBP-EGFP處理后H08910細胞的穿膜率升高，差異有統(tǒng)計學意義。經(jīng) TAT-OSBP-EGFP蛋白處理，H0891

7、0細胞內熒光強度高于對照組細胞;經(jīng)TAT-EGFP蛋白處理，H08910細胞內綠色熒光強度與對照組細胞相似;經(jīng)OSBP-EGFP蛋白處理，兩種細胞內未見明顯的綠色熒光。不同濃度TAT-OSBP-EGEP對H08910細胞活性無影響。
　　3.體外實驗中，融合蛋白TAT-OSBP-MKK6（E）對腫瘤細胞的生長有抑制效應，不同的細胞其抑制生長的程度有差別，對HO8910細胞株的抑制作用最大；TAT-OSBP-MKK6（E）可以選擇性

8、的介導卵巢癌 HO8910細胞株的凋亡；TAT-OSBP-MKK6(E)、TAT-MKK6(E)均不能介導正常卵巢上皮細胞的凋亡。
　　結論：
　　1.TAT-OSBP-EGFP綜合了TAT-EGFP、OSBP-EGFP兩組蛋白各自的廣泛穿膜和靶向定位的功能特點，具有最佳的優(yōu)勢。
　　2.細胞毒性實驗檢測結果顯示，不同濃度的TAT-OSBP-EGFP對H08910細胞活性無影響，表明TAT-OSBP-EGFP是一種較為