簡(jiǎn)介：本文內(nèi)容主要分為四部分第一部分SD大鼠ADSCS的分離、培養(yǎng)及鑒定目的從SD大鼠脂肪組織中分離得到間質(zhì)干細(xì)胞為后續(xù)研究提供種子細(xì)胞。方法1從SD大鼠的腹股溝部位切取脂肪組織結(jié)合酶消化法獲得一群細(xì)胞。2經(jīng)免疫磁珠系統(tǒng)分選后體外培養(yǎng)觀測(cè)其形態(tài)學(xué)特征及鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記。結(jié)果1獲取的細(xì)胞呈現(xiàn)類成纖維細(xì)胞樣可在體外穩(wěn)定擴(kuò)增傳代。2獲取的細(xì)胞表面標(biāo)志符合目前公認(rèn)的間質(zhì)干細(xì)胞表型特征。結(jié)論通過(guò)機(jī)械分離結(jié)合酶消化的方法經(jīng)分選后成功獲得SD大鼠ADSCS可體外培養(yǎng)為后續(xù)研究提供種子細(xì)胞。第二部分LIPUS對(duì)大鼠ADSCS增殖和成骨分化的影響目的探討LIPUS對(duì)體外分離培養(yǎng)的大鼠ADSCS增殖及成骨分化的影響。方法1流式細(xì)胞儀檢測(cè)陰性對(duì)照組和LIPUS組中1D、2D、3D、4D和5D時(shí)ADSCS細(xì)胞周期分布計(jì)算增殖指數(shù)。2CCK8法檢測(cè)陰性對(duì)照組和LIPUS組1D、3D、5D和7D時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較增殖程度。3設(shè)置陰性對(duì)照組、LIPUS組、成骨誘導(dǎo)組及LIPUS聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組于LIPUS刺激7D、14D時(shí)測(cè)定各組細(xì)胞堿性磷酸酶ALP活性于LIPUS刺激21D時(shí)采用VONKOSSA染色比較各組鈣結(jié)節(jié)形成。4RTPCR檢測(cè)陰性對(duì)照組和LIPUS組1D、3D、5D和7D時(shí)成骨相關(guān)基因包括RUNX2、ALP、OCN、BSP、COLLI的表達(dá)。5WESTERNBLOT檢測(cè)陰性對(duì)照組和LIPUS組7D和14D時(shí)成骨相關(guān)蛋白包括RUNX2和BSP的表達(dá)。結(jié)果1LIPUS組細(xì)胞增殖指數(shù)4D和5D時(shí)較對(duì)照組提高。2LIPUS組細(xì)胞增殖程度3D、5D和7D時(shí)較對(duì)照組加快。3LIPUS組ALP活性7D或14D時(shí)較對(duì)照組提高但低于成骨誘導(dǎo)組及LIPUS聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組成骨誘導(dǎo)組與LIPUS聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義另外各組細(xì)胞ALP活性測(cè)定結(jié)果在上述2個(gè)時(shí)間點(diǎn)間組內(nèi)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LIPUS作用能致ADSCS形成礦化結(jié)節(jié)但其礦化結(jié)節(jié)數(shù)量不及成骨誘導(dǎo)組和LIPUS聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組。4LIPUS組3D、5D或7D后RUNX2和ALPMRNA的表達(dá)增加5D或7D后LIPUS組BSP和OCNMRNA也表達(dá)增加沒(méi)有觀察到COLLIMRNA的改變。5LIPUS作用7D和14D后RUNX2和BSP蛋白表達(dá)量均增加BSP蛋白表達(dá)的增加從7D維持到14D。但14D后RUNX2蛋白量較7D時(shí)稍有下調(diào)。結(jié)論LIPUS能加速大鼠ADSCS增殖促進(jìn)大鼠ADSCS向成骨細(xì)胞分化。第三部分ΒCATENINSHRNA慢病毒載體構(gòu)建和沉默ΒCATENIN基因效果檢測(cè)目的構(gòu)建慢病毒載體沉默大鼠脂肪源干細(xì)胞ΒCATENIN基因表達(dá)為分析經(jīng)典的WNT通路在LIPUS促進(jìn)大鼠ADSCS成骨分化中的作用提供基礎(chǔ)。方法1針對(duì)大鼠ADSCS的ΒCATENIN基因設(shè)計(jì)出3種SHRNA打靶序列分別構(gòu)建3種PCSILENCERTMU6NEOGFPRNAI質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至大鼠ADSCS篩選出最有效的SHRNA打靶序列。2構(gòu)建含有該SHRNA序列的慢病毒載體。3用慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠ADSCS。4檢測(cè)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后沉默ΒCATENIN基因的效果。結(jié)果1用質(zhì)粒載體篩選出有效的ΒCATENIN基因SHRNA序列。2用構(gòu)建病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠ADSCS后可有效沉默ΒCATENIN基因。結(jié)論一種較為經(jīng)濟(jì)的方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沉默大鼠脂肪源干細(xì)胞ΒCATENIN基因。藉此可分析經(jīng)典的WNT通路在LIPUS促進(jìn)大鼠ADSCS成骨分化中的作用。第四部分經(jīng)典WNT信號(hào)通路在LIPUS促進(jìn)大鼠ADSCS成骨分化中的作用目的初步探討經(jīng)典的WNTΒCATENIN信號(hào)通路在LIPUS促進(jìn)大鼠ADSCS成骨分化過(guò)程中的作用。方法1REALTIMEPCR檢測(cè)正常ADSCS組、未轉(zhuǎn)染刺激組、轉(zhuǎn)染刺激組1D、3D、5D和7D時(shí)成骨相關(guān)基因包括RUNX2、ALP、BSP、COLLI的表達(dá)2WESTERNBLOT檢測(cè)正常ADSCS組、未轉(zhuǎn)染刺激組、轉(zhuǎn)染刺激組7D和14D時(shí)成骨相關(guān)蛋白包括RUNX2和BSP的表達(dá)。結(jié)果1正常的ADSCS在不接受LIPUS刺激的情況下所有基因基本呈現(xiàn)一致表達(dá)。2未轉(zhuǎn)染刺激組3D、5D和7D后RUNX2基因的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)轉(zhuǎn)染刺激組3D、5D和7D后RUNX2基因的表達(dá)也同樣出現(xiàn)上調(diào)但上調(diào)的幅度下降。3未轉(zhuǎn)染刺激組3D、5D和7D后出現(xiàn)ALP基因表達(dá)的上調(diào)轉(zhuǎn)染刺激組3D、5D和7D后也同樣出現(xiàn)較一致的上調(diào)上調(diào)的幅度無(wú)下降。4未轉(zhuǎn)染刺激組5D和7D后出現(xiàn)BSP基因的上調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)染刺激組5D和7D后也同樣出現(xiàn)上調(diào)但上調(diào)的幅度有所下降。5而三組之間I型膠原基因的表達(dá)始終沒(méi)有明顯的變化。6未轉(zhuǎn)染刺激組和轉(zhuǎn)染刺激組在7D和14D后均出現(xiàn)RUNX2蛋白的表達(dá)水平增加但14D后增幅稍低轉(zhuǎn)染刺激組與未轉(zhuǎn)染刺激組相比7D時(shí)增幅低。7未轉(zhuǎn)染刺激組7D和14D后出現(xiàn)BSP蛋白表達(dá)增加轉(zhuǎn)染刺激組僅14D后出現(xiàn)BSP蛋白增加。結(jié)論有效沉默大鼠ADSCS的ΒCATENIN基因阻斷經(jīng)典的WNT通路后能部分抑制LIPUS對(duì)ADSCS的促成骨分化。經(jīng)典的WNT通路在LIPUS促進(jìn)對(duì)體外分離培養(yǎng)的大鼠ADSCS成骨分化中僅起著部分的作用。

簡(jiǎn)介：佳木斯大學(xué)碩士學(xué)位論文缺氧對(duì)鼠下頜骨成骨細(xì)胞VEGF和TGFΒ表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究姓名闞娜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師關(guān)鍵20070610學(xué)術(shù)誠(chéng)信承諾本人鄭重聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)的研究成果，也不包含為獲得佳木斯大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)所使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說(shuō)明并表示了謝意。簽名I司塑壁日期塑2I12關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解佳木斯大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后應(yīng)遵循此規(guī)定簽名固地導(dǎo)師簽名幺絲日期塑Z』12

簡(jiǎn)介：隨著科技的進(jìn)步社會(huì)的發(fā)展車禍、高空墜落、毆打等均可以造成顱面骨缺損顱面骨處原發(fā)的腫瘤或是腦組織腫瘤浸潤(rùn)至顱骨都會(huì)造成骨質(zhì)的破壞以及神經(jīng)外科的去骨瓣減壓術(shù)等都會(huì)造成顱面骨的缺損。顱面骨的缺損對(duì)患者身心危害極大同時(shí)隨著人們對(duì)生活質(zhì)量和生存權(quán)利要求的提高對(duì)顱面骨缺損的修復(fù)和顱面部整形也提出了更高的要求。顱面骨骼解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜曲面變化大修復(fù)要求較高因此巨大、復(fù)雜部位的顱骨缺損的修復(fù)一直是整形外科具有挑戰(zhàn)性的課題之一。常規(guī)手術(shù)方法只是在一定程度上恢復(fù)了顱腔的完整性術(shù)中塑形時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜術(shù)后效果取決于術(shù)者技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)外形效果難盡人意。數(shù)字化技術(shù)在整形外科中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。目的本課題借助于CT三維重建技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助制造技術(shù)和鈦合金精密鑄造技術(shù)術(shù)前預(yù)制鈦植入體探討顱面骨缺損個(gè)性化修復(fù)的整形美容效果。方法本課題選用2003年9月至2011年11月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科收治顱面骨缺損患者9例其中男性6例女性3例年齡18～45歲平均34歲。所有患者均利用數(shù)字化技術(shù)進(jìn)行修補(bǔ)所有顱面骨缺損患者術(shù)前采用美國(guó)GE公司64排128層螺旋CT掃描得到二維虛擬數(shù)據(jù)將所得二維數(shù)據(jù)由GEADW44工作站分別進(jìn)行三維重建并利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和計(jì)算機(jī)輔助制造技術(shù)制造出個(gè)性化三維植入體行個(gè)性化的顱面骨缺損的修補(bǔ)。結(jié)果應(yīng)用數(shù)字化技術(shù)修復(fù)顱面骨缺損手術(shù)時(shí)間明顯減少全部患者術(shù)后恢復(fù)良好未出現(xiàn)感染、皮下血腫及頭皮刺痛等并發(fā)癥。術(shù)后CT復(fù)查鈦網(wǎng)與顱面骨適配度好。所有患者術(shù)后均隨訪6月2年無(wú)一例出現(xiàn)材料外露、鈦釘松動(dòng)、局部凹陷等情況。修補(bǔ)后原缺損部位和畸形外觀滿意弧度適宜雙側(cè)對(duì)稱患者滿意明顯改善了涉及到前額、眶上緣和顴骨等處的顱面骨缺損和畸形的整形美容效果。結(jié)論應(yīng)用數(shù)字化技術(shù)修補(bǔ)顱面骨缺損使手術(shù)規(guī)劃更加直觀顯著提高手術(shù)精度既節(jié)約了手術(shù)時(shí)間也減少了手術(shù)并發(fā)癥。計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和制作造技術(shù)制作出的個(gè)性化三維植入體最大程度的達(dá)到了生理解剖結(jié)構(gòu)的要求最大限度的恢復(fù)了患者容貌獲得了很好的美容效果達(dá)到了科學(xué)與美學(xué)的完美結(jié)合。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多人工關(guān)節(jié)硅酸二鈣涂層離子溶液促成骨能力及其機(jī)理的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的探討病灶清除、一期植骨融合內(nèi)固定治療胸椎結(jié)核的臨床療效。方法回顧我院骨二科2005年5月至2008年4月對(duì)36例胸椎結(jié)核患者行前路、側(cè)前方及后路病灶清除、一期椎體間植骨融合內(nèi)固定治療。男19例，女17例，年齡1760歲，平均322歲。病變破壞2個(gè)椎體23例，3個(gè)椎體7例，4個(gè)椎體6例。所有患者均有不同程度的后凸畸形，后凸角10°75°，平均21°，22例伴有神經(jīng)功能障礙，術(shù)前正規(guī)抗癆4周。結(jié)核病灶位于頸胸結(jié)合部3例，2例用頸胸結(jié)合部前入路手術(shù)，1例使用后正中入路；T3T5椎6例均使用肋橫突旁入路；T5以下共27例，9例使用經(jīng)胸腔胸膜外入路，10例用肋橫突旁，4例采用開(kāi)胸手術(shù)，4例后正中入路。術(shù)中行病灶清除，自體骼骨和、或肋骨椎間植骨融合內(nèi)固定，術(shù)后繼續(xù)正規(guī)抗癆治療1218個(gè)月。結(jié)果全部病例隨訪618個(gè)月，平均13個(gè)月，所有患者術(shù)后胸背部疼痛減輕，切口一期愈合，血沉術(shù)后一個(gè)月逐漸恢復(fù)正常，一例結(jié)核膿腫復(fù)發(fā)，經(jīng)督導(dǎo)化療后治愈，術(shù)后后凸角度矯正至0°15°，平均4°，最終隨訪時(shí)畸形矯正角度丟失14°，平均2°。自體骨植骨于術(shù)后3個(gè)月開(kāi)始融合，隨訪期間無(wú)一例發(fā)生植骨移位，骨折塌陷。22例伴有神經(jīng)功能障礙者，術(shù)后FRANKEL分級(jí)提高12級(jí)，大部分完全恢復(fù)，無(wú)明顯神經(jīng)功能加重，術(shù)后發(fā)生胸腔積液3例，胸腔閉式引流處理后痊愈。結(jié)論根據(jù)結(jié)核病灶的位置及累及的范圍選擇恰當(dāng)?shù)氖中g(shù)入路清除病灶、一期椎間植骨融合內(nèi)固定治療胸椎結(jié)核可有效清除結(jié)核病灶，矯正后凸畸形，重建脊柱的穩(wěn)定性，改善神經(jīng)功能，臨床效果良好。

簡(jiǎn)介：研究目的骨性關(guān)節(jié)炎OSTEOARTHRITIS，OA是老年人群發(fā)病率較高的疾病之一，是在全身因素和局部因素的綜合作用下，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生生化、結(jié)構(gòu)和代謝改變，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨軟化、破潰和局部剝脫以及關(guān)節(jié)邊緣骨與軟骨贅生物形成等病理改變，臨床上可產(chǎn)生關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等癥狀，嚴(yán)重影響老年人的身體健康，是致殘的重要原因。在骨關(guān)節(jié)炎的病理改變中，大量炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放是造成局部關(guān)節(jié)改變的重要因素。其中IL1和TNFA是OA病理過(guò)程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細(xì)胞因子，其他細(xì)胞因子對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞往往是間接通過(guò)IL1和TNFA發(fā)揮作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)OA的發(fā)病機(jī)制和治療研究很多，但療效不盡如人意，近些年來(lái)自殺基因治療為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了一種新的方法。本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用基因治療的方法，利用重組重組腺相關(guān)病毒載體RAAV，將外源性抑炎性因子基因聯(lián)合自殺基因直接體內(nèi)轉(zhuǎn)染兔膝關(guān)節(jié)后，觀察對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療效果。有可能在骨關(guān)節(jié)炎的治療上去的新的進(jìn)展。方法采用切斷并切除前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板的方法將32只新西蘭白兔的右后膝關(guān)節(jié)制成OA的動(dòng)物模型，將兔子平均分成四組，將有RAAV包裝的目的基因通過(guò)髕韌帶注射入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，A組RAAV21IL1RA1ML，B組RAAV21HSVTK1ML，C組RAAV21TKIL1RA1ML，D組為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染含空質(zhì)粒的RAAV211ML。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射24小時(shí)后，每只動(dòng)物給予靜脈內(nèi)注射更昔洛韋GCV5MG天，一天兩次，持續(xù)三天。注射后第7天，用1ML生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，抽取關(guān)節(jié)腔灌洗液用ELISA分析外源基因的表達(dá)情況，注射后第14天，處死動(dòng)物，用無(wú)菌生理鹽水1ML灌洗關(guān)節(jié)腔，抽取關(guān)節(jié)罐洗液進(jìn)行IL1RA、IL1Β、TNFA及TGFΒ1的ELISA分析，取滑膜組織通過(guò)REA1TIMEPCR方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)，并用相對(duì)定量的方法2△△CT進(jìn)行目的基因表達(dá)的分析，目的基因包括IL1Β、TNFΑ、及TGFΒ1。取關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行固定，包埋，切片和HE染色及番紅O染色，鏡下觀察軟骨細(xì)胞排列情況，并進(jìn)行軟骨組織學(xué)評(píng)分。結(jié)果通過(guò)ELISA檢測(cè)分析接受IL1RA基因治療的A組及IL1RA聯(lián)合HSVTK基因治療的C組在外源基因注射后第7天和第14天，關(guān)節(jié)液內(nèi)有穩(wěn)定的外源基因IL1RA的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染HSVTK基因的B組及未有基因轉(zhuǎn)染的對(duì)照組D組未檢測(cè)到人IL1RA的表達(dá)。說(shuō)明外源基因能在關(guān)節(jié)腔內(nèi)表達(dá)。通過(guò)REALTIMEPCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)量，IL1Β的表達(dá)量三個(gè)實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組，此外C組即IL1RA聯(lián)合HSVTK基因治療組明顯低于A組IL1RA基因治療組和B組HSVTK基因治療組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義TNFΑ的表達(dá)量對(duì)照組高于三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，聯(lián)合基因治療組低于單基因治療組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義TGFΒ1的表達(dá)量對(duì)照組明顯高于三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。通過(guò)ELISA檢測(cè)，IL1Β在A組、B組、C組的水平明顯低于對(duì)照組D組，TNFΑ的表達(dá)水平在對(duì)照組明顯高于三個(gè)治療組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義TGFΒ1水平對(duì)照組明顯高于導(dǎo)入外源性基因的A、B、C三組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±SEM表示，N3，P＜005。HE染色及番紅O示染色未轉(zhuǎn)染基因的對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙并有軟骨剝脫，外源性基因?qū)牒?，軟骨損害及軟骨基質(zhì)降解明顯減輕。關(guān)節(jié)軟骨的MANKINS評(píng)分顯示對(duì)照組的評(píng)分8264±0044明顯高于三個(gè)基因治療組，而聯(lián)合基因治療組的評(píng)分明顯低于兩組單一基因治療組。結(jié)論我們將攜帶目的基因的重組腺相關(guān)病毒載體注射入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，使其在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的目的基因。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，IL1RA因聯(lián)合自殺基因HSVTK對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的基因治療優(yōu)于單純的使用IL1RA基因或HSVTK基因治療，不僅可以有效地減少豐要促炎性因子IL1Β的含量，減輕滑膜炎癥，同時(shí)還可以減輕軟骨損害和軟骨基質(zhì)降解，以此來(lái)達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。

簡(jiǎn)介：自體骨移植和異體骨嫁接技術(shù)是治療常見(jiàn)骨骼類疾病的傳統(tǒng)方法，但由于這兩種方法存在免疫排斥、受供體來(lái)源限制、患者痛苦大等缺點(diǎn)，骨組織工程受到廣泛的關(guān)注。不同原因造成的骨缺損，其部位和形態(tài)差別很大，海藻酸鈣微膠珠能夠較好的適應(yīng)不同形態(tài)的要求。因此，本課題將ADSCS的微膠珠置于轉(zhuǎn)瓶的三維動(dòng)態(tài)環(huán)境中誘導(dǎo)分化，探討ADSCS在微膠珠內(nèi)的骨向分化。本文通過(guò)綜合考慮海藻酸鈉溶液的濃度、氯化鈣溶液的濃度及骨粉的密度對(duì)海藻酸鈣骨粉微膠珠機(jī)械強(qiáng)度及傳質(zhì)性能的影響，制備用于ADSCS的體外增殖分化的最優(yōu)化的微膠珠。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，海藻酸鈉溶液的濃度是決定微膠珠機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)性能的決定因素，其次為氯化鈣溶液的濃度，骨粉密度的影響最小。當(dāng)海藻酸鈉溶液的濃度為25％，氯化鈣濃度為4％，骨粉密度為50MGML時(shí)微膠珠的性能最好，確定為最佳制備工藝。死活染色、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及成骨誘導(dǎo)檢測(cè)表明實(shí)驗(yàn)所用的ADSCS生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞活性良好并且具有成骨分化潛能。微膠珠內(nèi)ADSCS死活染色及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，海藻酸鈣骨粉微膠珠生物相容性良好，ADSCS能夠保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞活性并且最佳包埋密度為5106CELLSML。ADSCS在微膠珠內(nèi)骨向分化過(guò)程中時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和兩組對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行，其中實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)瓶中ADSCS在海藻酸鈣骨粉微膠珠內(nèi)的成骨誘導(dǎo)，對(duì)照組Ⅰ為靜態(tài)下ADSCS在海藻酸鈣骨粉微膠珠內(nèi)的成骨誘導(dǎo)，對(duì)照組Ⅱ?yàn)殪o態(tài)下ADSCS在海藻酸鈣微膠珠內(nèi)的成骨誘導(dǎo)。微膠珠內(nèi)的ADSCS成骨誘導(dǎo)14D后，分別采用堿性磷酸酶ALP微量酶標(biāo)法和ALP染液定量和定性檢測(cè)培養(yǎng)液中堿性磷酸酶的含量，誘導(dǎo)21D后分別進(jìn)行茜素紅染色和VONKOSSA染色，檢測(cè)ADSCS內(nèi)礦化結(jié)節(jié)的情況。成骨誘導(dǎo)的前2D，三組實(shí)驗(yàn)均未檢測(cè)到培養(yǎng)液中的堿性磷酸酶，從第3D開(kāi)始，三組實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)液中開(kāi)始逐漸檢測(cè)到ALP，基本呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中的ALP含量最高，對(duì)照組ⅠALP含量其次，對(duì)照組ⅡALP的含量最低。誘導(dǎo)培養(yǎng)至第14D，細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始生成礦化結(jié)節(jié)，ALP的含量均開(kāi)始下降。茜素紅染色和VONKOSSA染色顯示三組微膠珠內(nèi)部均可見(jiàn)大量的不規(guī)則的紅色礦化結(jié)節(jié)，實(shí)驗(yàn)組礦化結(jié)節(jié)最多，對(duì)照組Ⅰ其次，對(duì)照組Ⅱ礦化結(jié)節(jié)最少。因此，骨粉和轉(zhuǎn)瓶的三維動(dòng)態(tài)環(huán)境均能夠促進(jìn)ADSCS在微膠珠內(nèi)的成骨分化，而動(dòng)態(tài)環(huán)境的促進(jìn)作用更明顯。

簡(jiǎn)介：新疆醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文慢性化膿性中耳炎骨導(dǎo)聽(tīng)力損失的臨床分析姓名張弓劍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師張勁200904新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位論文2CLINICALANALYSISOFBONECONDUCTIVEHEARINGLOSSINCHRONICSUPPURATIVEOTITISMEDIAPOSTGRADUATEZHANGGONGJIANSUPERVISORZHANGJINGABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHERELATIONSHIPBETWEENTHECHRONICSUPPURATIVEOTITISMEDIAANDSENSORINEURALHEARINGLOSS,ANDTHECAUSEOFINCREASEDBONECONDUCTIVETHRESHOLDINCHRONICSUPPURATIVEOTITISMEDIAMETHODSSINCEJANUARY2007TOJANUARY2009,TREATED106CASESOFUNILATERALCHRONICSUPPURATIVEOTITISMEDIAPATIENTSWEREANALYZEDRETROSPECTIVELYRESULTS1SUFFERINGEARS’AVERAGEBONECONDUCTIVETHRESHOLDATEACHFREQUENCY025KHZ,05KHZ,1KHZ,2KHZ,4KHZISGREATERTHANTHEHEALTHEARS’THEDIFFERENCESARESTATISTICALLYSIGNIFICANTATALLAROUND2AT4KHZDEPARTMENT,DURATION10YEARSGROUP’S,ANDTHEREISSTATISTICALSIGNIFICANCE3THEAVERAGEBONECONDUCTIVETHRESHOLDSOFCHRONICSUPPURATIVEOTITISMEDIACHOLESTEATOMAANDBONEULCERTYPEATEACHFREQUENCYAREGREATERTHANTHECSIMPLECHRONICSUPPURATIVEOTITISMEDIAANDHAVESTATISTICALSIGNIFICANCE4THEAVERAGEBONECONDUCTIVETHRESHOLDOFOSSICULARCHAINDAMAGEGROUPGREATERTHANTHEINTACTOSSICULARCHAINGROUPATTHEFREQUENCY2KHZ,4KHZ,ANDTHEREISSTATISTICALSIGNIFICANCE5THEAVERAGEBONECONDUCTIVETHRESHOLDOFAGE40YEARSGROUPISGREATERTHANTHEAGE40YEARSGROUPAT2KHZ,4KHZDEPARTMENT,ANDTHEREISSTATISTICALSIGNIFICANCE6THEBONECONDUCTIVETHRESHOLDOFTHEAGEOF2040YEAROLDGROUPISGREATERAGE20YEARSGROUP,ANDTHEREISSTATISTICALSIGNIFICANCE6THERATIOOFTHENUMBEROFABNORMALEARSCAUSEDBYSTAPHYLOCOCCUSAUREUS,PSEUDOMONASAERUGINOSA,ISLARGERTHANTHERATIOOFTHENUMBEROFABNORMALEARSCAUSEDBYOTHERBACTERIALANDTHEREISSTATISTICALSIGNIFICANCEAT4KHZDEPARTMENTCONCLUSION1CHRONICSUPPURATIVEOTITISMEDIAMAYLEADGREATERBONECONDUCTIVETOSUFFERINGEARSANDCANCAUSESENSORINEURALHEARINGLOSS2THEDURATIONHASAREALATIONSHIPWITHTHEHIGHERBONECONDUCTIVETHRESHOLDOFTHEEARSOFCHRONICSUPPURATIVEOTITISMEDIATHELONGERDURATIONCOULDCAUSETHEMOREDAMAGETOTHEHIGHFREQUENCYDEPARTMENT3DIFFERENTTYPESOFOTITISMEDIALEADTOTHEDIFFERENTINCREASEDBONECONDUCTIVETHRESHOLDS4THE

簡(jiǎn)介：分類號(hào)R783．5密級(jí)單位代碼10422學(xué)號(hào)201113942⑧∥蔡辦呈碩士學(xué)位論文專業(yè)學(xué)位論文題目類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠正畸牙移動(dòng)中牙槽骨改建的變化及脂聯(lián)素的作用THECHANGEOFALVEOLARBONEREMODELINGANDTHEEFFECTOFADIPONECTININRHEUMATOIDARTHRITISRATS’ORTHODONTICTOOTHMOVEMENT2口／3年與月，7日目錄中文摘要??????????????????????????????1ABSTRACT??????????????????????????????????????。4符號(hào)說(shuō)明??????????????????????????????81．￡一}一月U舌??????????????????????????????????????????．．9材料與方法????????????????????????????．．101．實(shí)驗(yàn)材料?????????????????????????????102．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組??????????????????????????133．實(shí)驗(yàn)方法?????????????????????????????134．統(tǒng)計(jì)方法?????????????????????????????20結(jié)果??????????????????????????????????????????211．CIA模型評(píng)價(jià)???????????????????????????212．大鼠第一磨牙近中移動(dòng)距離表1、圖5??????????????．213．HE染色圖79?????????????????????????214．TRAP染色表2、圖6，10．12????????????????????225．血清中IL．1ET、TNF．Q濃度變化表3．4、圖13．14??????????226．牙槽骨中RANKL、OPGMRNA表達(dá)變化表56、圖15．16?????．．23討論??????????????????????????????????????????231．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇???????????????????????????232．類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型CIA模型????????????????????233．大鼠上頜第一磨牙近中移動(dòng)模型???????????????????244．類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎對(duì)骨改建及正畸牙移動(dòng)的影響????????????．．?．265。脂聯(lián)素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響????????????????????29結(jié)論????????????????．．?????．???????????????????一31附圖表???????????????????????????????32參考文獻(xiàn)?????????????????????????????．．42致謝??????????????????????????????????????????49臨床病例報(bào)告???????????????????????????．．50

簡(jiǎn)介：目的1通過(guò)新鮮成人尸體下肢標(biāo)本進(jìn)行顯微解剖，明確縫匠肌肌皮動(dòng)脈穿支和肌間隙穿支動(dòng)脈的區(qū)域分布特征，為縫匠肌穿支肌皮瓣的臨床應(yīng)用提供解剖學(xué)基礎(chǔ)依據(jù)。2觀察股動(dòng)脈及其分支血管的分布圖像，測(cè)量股動(dòng)脈等其它知名動(dòng)脈所發(fā)出的主要穿支在體表距定位點(diǎn)之間的距離，獲取統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，為臨床開(kāi)展肌皮瓣的應(yīng)用模擬皮瓣設(shè)計(jì)。方法1對(duì)12側(cè)經(jīng)紅色乳膠灌注的成人下肢新鮮標(biāo)本逐層解剖，其中完整標(biāo)本2具，于髖穴平面離斷且股骨頭完整的下肢標(biāo)本10具。首先在完整尸體標(biāo)本上于股動(dòng)脈上段在體表的投影線上做垂直縱行切口，解剖尋找經(jīng)縫匠肌及其內(nèi)、外側(cè)緣的穿支然后在離斷的下肢標(biāo)本上結(jié)合縫匠肌走向及股動(dòng)脈的體表投影，分別在縫匠肌內(nèi)、外側(cè)緣旁開(kāi)5CM左右做斜形切口觀察穿支分布情況。以上解剖均分別在肉眼及顯微鏡下觀察縫匠肌動(dòng)脈血供特征，獲取縫匠肌肌皮穿支和肌間隙穿支數(shù)目及優(yōu)勢(shì)血管區(qū)域分布特征。2由影像科收集做下肢血管CT檢查、且股動(dòng)脈及其主要大的可見(jiàn)分支檢查結(jié)果正常的病人50例，通過(guò)觀察股動(dòng)脈及旋股外側(cè)動(dòng)脈等主要知名血管所發(fā)出的主要分支（即與縫匠肌有關(guān)的穿支）血管的分布圖像，測(cè)量股動(dòng)脈及其分支所發(fā)出的主要的可見(jiàn)穿支在體表距設(shè)定標(biāo)志之間的距離，所得資料采用SPSS130數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行經(jīng)T檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法處理。根據(jù)穿支大致分布特征模擬皮瓣設(shè)計(jì)。結(jié)果由股動(dòng)脈等主要知名動(dòng)脈發(fā)出進(jìn)入縫匠肌及其表面皮膚的穿支血管約712支，其中以縫匠肌中、上段的穿支分布較為集中。在縫匠肌上段穿支主要為股動(dòng)脈和旋股外側(cè)動(dòng)脈降支發(fā)出，其中股動(dòng)脈發(fā)出肌皮穿支1～2支，管徑115±020MM，蒂部長(zhǎng)050±010CM。肌間隙穿支1～2支，管徑105±010MM，蒂部長(zhǎng)025±010CM旋股外側(cè)動(dòng)脈發(fā)出0～1支肌皮穿支，管徑180±020MM，蒂部長(zhǎng)325±110CM。肌間隙穿支1～2支，管徑175±020MM，蒂部較長(zhǎng)725±140CM。在縫匠肌中段穿支主要為股動(dòng)脈發(fā)出，平均3～4支，管徑130±020MM。肌皮穿支蒂部長(zhǎng)120±010CM，近端的肌間隙穿支蒂稍長(zhǎng)145±020CM，遠(yuǎn)端的肌間隙穿支蒂部較短095±020CM。結(jié)論1縫匠肌中、上段的肌皮穿支和肌間隙穿支呈節(jié)段性分布，血供豐富。肌皮穿支與肌間隙穿支之間，各肌間隙穿支之間在皮下形成廣泛的交通吻合。2肌皮穿支變異較多，如血管細(xì)小，設(shè)計(jì)肌皮瓣需將蒂部相鄰的肌間隙穿支包含在內(nèi)以確保組織瓣成活。3縫匠肌內(nèi)、外側(cè)緣的肌間隙穿支分布密集且位置相對(duì)恒定，也可以設(shè)計(jì)以肌間隙穿支為血管蒂的穿支皮瓣游離移植修復(fù)肢體組織缺損。

簡(jiǎn)介：徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文TV－CDFI對(duì)子宮腺肌病月經(jīng)周期中子宮血流動(dòng)力學(xué)的研究姓名卓曉英申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師崔建華20090401徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文2TV－CDFI對(duì)子宮腺肌病月經(jīng)周期子宮血流動(dòng)力學(xué)變化的研究TV－CDFI對(duì)子宮腺肌病月經(jīng)周期子宮血流動(dòng)力學(xué)變化的研究中文中文摘要摘要目的目的應(yīng)用經(jīng)陰道彩色多普勒血流顯像（TRANSVAGINALCOLDOPPLERFLOWIMAGING，TV－CDFI）觀測(cè)子宮腺肌?。ˋDENOMYOSIS，AM）患者及健康生育期婦女月經(jīng)不同時(shí)期子宮血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，通過(guò)兩者對(duì)比，研究AM血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)隨月經(jīng)周期的變化規(guī)律，探討應(yīng)用多普勒超聲檢查提高該病早期診斷率，減少漏診率、誤診率的可行性，為臨床早期治療提供依據(jù)。方法方法選擇月經(jīng)周期規(guī)律（28～30天）、臨床高度懷疑患有AM的婦女為AM組，選擇月經(jīng)周期規(guī)律（28～30天）、無(wú)子宮肌瘤等相關(guān)婦產(chǎn)科疾患、半年內(nèi)未服用過(guò)刺激排卵及激素類藥物的婦女為健康生育期婦女組，應(yīng)用TV－CDFI分別于月經(jīng)周期的卵泡早期、卵泡成熟期、黃體中期、黃體晚期4個(gè)時(shí)期觀測(cè)兩組研究對(duì)象的子宮動(dòng)脈（UTERINEARTERY，UA）及螺旋動(dòng)脈（HELICINEARTERY，HA）血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，對(duì)隨訪經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)、資料完整的28例AM患者和資料完整的30例健康生育期婦女作回顧性分析，分析每組不同時(shí)期間及兩組相應(yīng)時(shí)期間阻力指數(shù)RESISTENTINDEX，RI和收縮期峰值舒張末期流速比值（THEPEAKVALUEFLOWVELOCITYDURINGTHESYSTOLICPHASETHEFLOWVELOCITYDURINGTHEENDDIASTOLICPHASE，SD）的差異。結(jié)果結(jié)果1、AM患者月經(jīng)周期中子宮血流特點(diǎn)（1）雙側(cè)UA全部顯示清晰，取樣成功率100，月經(jīng)不同時(shí)期功能卵巢（排卵側(cè)卵巢）同側(cè)和對(duì)側(cè)UA的RI、SD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，卵泡早期和卵泡成熟期RI、SD略高于黃體中期和黃體晚期，

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簡(jiǎn)介：研究背景骨質(zhì)疏松及其相關(guān)骨折嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，并由此帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)健康負(fù)擔(dān)；骨質(zhì)疏松及其骨折的治療多年以來(lái)一直是困繞骨科臨床醫(yī)生的難題之一，隨著我人口的老齡化，骨質(zhì)疏松及其骨折患者也將逐漸增加，因此尋找新的、療效切實(shí)可靠且具有突破性進(jìn)展的治療方法具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。骨質(zhì)疏松基本病理機(jī)制為骨吸收和形成骨重建偶聯(lián)的失衡，骨形成的不足，或和骨吸收的增強(qiáng)導(dǎo)致骨量的減少，骨組織微結(jié)構(gòu)的退變、骨脆性增加和骨強(qiáng)度下降，骨折的易感性增加，骨折后的愈合能力顯著降低。MSCS是成體干細(xì)胞之一，具有多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和等多種細(xì)胞，骨質(zhì)疏松個(gè)體的MSCS數(shù)量減少，質(zhì)量也下降，增殖和成骨細(xì)胞分化能力減弱，成骨能力也顯著降低1。MSCS轉(zhuǎn)染相關(guān)誘導(dǎo)因子基因后，不僅其增殖能力沒(méi)有受到影響，而且可以加強(qiáng)其定向分化的能力，比如轉(zhuǎn)導(dǎo)入骨誘導(dǎo)基因后，能有效促進(jìn)骨的形成，修復(fù)骨缺損2，從而為骨質(zhì)疏松及其骨折的基因治療提供了一個(gè)新的平臺(tái)。骨誘導(dǎo)因子是一類可促進(jìn)局部或全身骨形成的的生物分子。LMP1作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，啟動(dòng)體內(nèi)骨的形成的同時(shí)，刺激包括多種BMPS在內(nèi)不同骨誘導(dǎo)因子合成和分泌，促進(jìn)臨近的細(xì)胞分化并直接參加骨膜或軟骨內(nèi)成骨3，為骨折的修復(fù)提供非常有利的環(huán)境，因此是理想的候選基因。MSCS的生物學(xué)特性表明它該基因最佳的載體。與其它慢性疾病不同，OP骨折的治療不必也不需要讓所轉(zhuǎn)染的基因長(zhǎng)達(dá)數(shù)周或數(shù)月持續(xù)的表達(dá)直至疾病痊愈，因而使轉(zhuǎn)基因方法更加切實(shí)可行。目的利用重組腺病毒載體ADLMP1體外轉(zhuǎn)染MSCS，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞成骨活性的檢測(cè)，明確LMP1基因的成骨促進(jìn)作用，為基因治療骨質(zhì)疏松做基礎(chǔ)研究方法1分離培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞，提取提取總RNA，設(shè)計(jì)特異性引物并RTPCR獲取LMP1基因，電泳驗(yàn)證，切膠回收純化。2利用GATEWAY技術(shù)構(gòu)建ADLMP1重組腺病毒載體，并行相關(guān)酶切電泳以及測(cè)序驗(yàn)證。3重組腺病毒載體在293A細(xì)胞中的包裝。并初步確定感染復(fù)數(shù)MOI4分離培養(yǎng)大鼠MSC細(xì)胞，鑒定。5利用重組腺病毒感染第三代MSC細(xì)胞，通過(guò)WESTERNBLOTING檢測(cè)LMP1基因在MSCS中的表達(dá)；通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶、膠原蛋白I、骨鈣素以及，驗(yàn)證LMP1基因的成骨促進(jìn)作用。結(jié)果1成功體外分離培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞以及提取總RNA，利用RTPCR獲取LMP1基因，通過(guò)電泳初步鑒定。2成功構(gòu)建重組腺病毒載體ADLMP1，通過(guò)酶切電泳以及測(cè)序驗(yàn)證完全正確。3通過(guò)兩次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，提取病毒DNA，PCR鑒定成功；成功確定重組腺病毒載體感染復(fù)數(shù)。4成功分離培養(yǎng)SD大鼠MSC細(xì)胞，并通過(guò)成脂、成骨誘導(dǎo)鑒定以及表面標(biāo)記物鑒定。5重組腺病毒感染MSC細(xì)胞后，可檢測(cè)LMP1基因的表達(dá)，并且通過(guò)與對(duì)照組的比較，驗(yàn)證了LMP1基因的成骨促進(jìn)作用。結(jié)論利用構(gòu)建包裝成功的重組腺病毒載體ADLMP1感染MSC細(xì)胞，可以檢測(cè)到LMP1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，并通過(guò)相關(guān)成骨活性檢測(cè)，證明了LMP1基因的成骨促進(jìn)作用，為后期的骨質(zhì)疏松的基因治療打下基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：關(guān)節(jié)軟骨損傷一直是骨科面臨的難題之一。關(guān)節(jié)軟骨本身缺乏營(yíng)養(yǎng)血管，再生細(xì)胞和體液因子少，軟骨的細(xì)胞基質(zhì)比低，一旦關(guān)節(jié)軟骨損傷，其再生能力十分有限。此外，再生軟骨的生物化學(xué)和機(jī)械性能不等同于正常軟骨，容易退變和侵蝕。組織工程修復(fù)軟骨手段的目的是將修復(fù)物質(zhì)運(yùn)送到受損部位并且固定于該位置以達(dá)到有效的修復(fù)。從研究結(jié)果來(lái)看，雖然研究者們應(yīng)用了多種研究方法、生物材料、種子細(xì)胞和修復(fù)方法，但修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的長(zhǎng)期效果并不令人滿意，存在著組織工程軟骨中心強(qiáng)度低、難以和宿主正常軟骨整合、軟骨和軟骨下骨的斷裂分層問(wèn)題等難題13。研究目的通過(guò)最近新興的模擬微重力技術(shù)，將軟骨組織工程中應(yīng)用廣泛的膠原、殼聚糖與ΒTCP有機(jī)復(fù)合，模仿體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的分層結(jié)構(gòu)，構(gòu)建層狀梯度復(fù)合材料，并將擴(kuò)增的兔擴(kuò)增的經(jīng)成骨誘導(dǎo)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BONEMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSCS）和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞植入其中體外培養(yǎng)，觀察軟骨細(xì)胞在膠原殼聚糖Β磷酸三鈣層狀梯度修復(fù)體中的黏附、增殖、生長(zhǎng)情況及生物學(xué)性狀變化，以評(píng)價(jià)微重力培養(yǎng)方法在軟骨組織工程的實(shí)用性及該復(fù)合材料作為關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架的可行性。研究方法以細(xì)胞和支架材料為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以普通培養(yǎng)和微重力培養(yǎng)分兩組對(duì)照。MTT實(shí)驗(yàn)分組7個(gè)時(shí)間組1天、4天、7天、10天、13天、17天、19天；8個(gè)平行孔組，兩培養(yǎng)組共112孔。1成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)和軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)用全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)新西蘭兔原代BMSCS，體外擴(kuò)增后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，3周后檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)生成情況取新西蘭幼兔的關(guān)節(jié)軟骨消化培養(yǎng)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增，取2、3代細(xì)胞行S100細(xì)胞免疫化學(xué)染色。2種子細(xì)胞和材料復(fù)合將誘導(dǎo)成功后的成骨細(xì)胞和前4代軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞與修復(fù)體復(fù)合體外普通培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀模擬微重力培養(yǎng)，進(jìn)行MTT檢測(cè)比較兩組細(xì)胞增殖情況并觀察模擬微重力對(duì)細(xì)胞的影響；培養(yǎng)3W后行掃描電鏡檢查觀察軟骨細(xì)胞在修復(fù)體材料內(nèi)黏附生長(zhǎng)情況；3W后，細(xì)胞和材料復(fù)合物進(jìn)行脫鈣、石蠟包埋、切片，行蘇木精伊紅染色、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色，觀察成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的生物學(xué)性狀變化及模擬微重力對(duì)復(fù)合物的力學(xué)影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MTT實(shí)驗(yàn)中，相同時(shí)間點(diǎn)兩組之間的比較用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；同組不同時(shí)間點(diǎn)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析（ONEWAYANOVA）；兩組整體之間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。Α005為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)。研究結(jié)果1細(xì)胞形態(tài)初接種時(shí)BMSCS呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中，24H后開(kāi)始貼壁，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，少量多角形，約1周左右細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶。加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液后細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，其形態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)胞逐漸增大，進(jìn)而出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)。2周后細(xì)胞間可見(jiàn)圓形或卵圓形的鈣化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍細(xì)胞呈放射狀分布。堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，VONKOSSA法檢測(cè)出鈣化結(jié)節(jié)。體外單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中，5H后開(kāi)始貼壁，細(xì)胞呈扁平狀，大多數(shù)三角形，少量多角形，約1周細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶，呈“鋪路石”樣。第2、3代細(xì)胞S100免疫細(xì)胞化學(xué)染色胞漿內(nèi)呈陽(yáng)性反應(yīng)。2細(xì)胞支架光鏡下觀察細(xì)胞懸液滴加于經(jīng)預(yù)濕處理的復(fù)合支架材料上，支架材料迅速膨脹，證明細(xì)胞擴(kuò)散到支架內(nèi)。接種24H后，倒置顯微鏡下見(jiàn)材料不透明，無(wú)法觀察其內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，但可見(jiàn)大量成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞貼附在材料旁培養(yǎng)板內(nèi)。3MTT檢測(cè)種子細(xì)胞和材料復(fù)合后，除第1天兩組之間無(wú)顯著性差異外（P0878），其余時(shí)間點(diǎn)兩組之間有顯著性差異（P005），模擬微重力組明顯比培養(yǎng)板組細(xì)胞增殖力高。兩組之間整體比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0000），證明模擬微重力對(duì)成骨細(xì)胞在修復(fù)體內(nèi)的增殖比普通培養(yǎng)起到了更好的促進(jìn)作用。4掃描電鏡培養(yǎng)3W后，普通培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞成團(tuán)地吸附于支架表面，從切開(kāi)的材料上可以觀察到有部分細(xì)胞吸附于空隙內(nèi)，細(xì)胞間通過(guò)突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上；模擬微重力培養(yǎng)組中細(xì)胞在修復(fù)體上分布更加均勻，且其中心部位軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯比普通培養(yǎng)組多。5HE染色和免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果3W后，HE染色顯示培養(yǎng)板組的細(xì)胞多聚集在修復(fù)體表面，細(xì)胞數(shù)量明顯多于修復(fù)體內(nèi)部，而模擬微重力組材料表面和材料內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量相差不大，分布較均勻，修復(fù)體內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量明顯比普通培養(yǎng)組多。兩組免疫組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞團(tuán)中有基質(zhì)分泌，沉積于細(xì)胞周圍；含有ΒTCP端Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性，不含有ΒTCPⅡ型膠原免疫組織化學(xué)染色示胞漿內(nèi)呈陽(yáng)性反應(yīng)。免疫熒光染色檢測(cè)顯示同一層狀修復(fù)體上成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞同時(shí)增殖，無(wú)明顯分界。結(jié)論1成功培養(yǎng)出兔原代軟骨細(xì)胞和BMSCS，并成功誘導(dǎo)BMSCS為成骨細(xì)胞，為進(jìn)一步的細(xì)胞和材料的接種提供了數(shù)量充足和生物學(xué)性能良好的種子細(xì)胞。2膠原殼聚糖ΒTCP層狀梯度復(fù)合體模擬了正常關(guān)節(jié)軟骨分層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞相容性好，能提供細(xì)胞生長(zhǎng)的三維環(huán)境。3軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞聯(lián)合種植在同一修復(fù)體上，體外構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供的基礎(chǔ)。4轉(zhuǎn)壁式旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀產(chǎn)生的模擬微重力可以使成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在修復(fù)體內(nèi)高密度生長(zhǎng)，能更好的促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌，提高了組織工程化關(guān)節(jié)軟骨體外培養(yǎng)的質(zhì)量，為關(guān)節(jié)軟骨組織工程的研究開(kāi)辟了新的道路。

簡(jiǎn)介：目的血管鈣化可發(fā)生在老年，動(dòng)脈粥樣硬化以及代謝性疾病中，例如糖尿病和終末期腎病。TGFΒ1能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞VSMCS的分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣化。3羥3甲基戊二酰輔酶A抑制劑（他汀類藥物）在心血管疾病中發(fā)揮出多方面的益處。ΒCATENIN轉(zhuǎn)移至核內(nèi)參與血管鈣化過(guò)程促進(jìn)特定基因的表達(dá)。自噬作為高度保守的細(xì)胞活動(dòng)通過(guò)溶酶體依賴途徑調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)蛋白更新。然而，目前關(guān)于他汀類藥物通過(guò)自噬和ΒCATENIN信號(hào)通路對(duì)平滑肌細(xì)胞成骨樣分化的影響研究尚少。有關(guān)血管鈣化的調(diào)節(jié)機(jī)制已有很多理論觀點(diǎn)，但是自噬活動(dòng)在調(diào)控平滑肌細(xì)胞成骨樣分化中的作用和分子機(jī)制研究尚少。有學(xué)者認(rèn)為作為細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制的自噬活動(dòng)可直接促進(jìn)膠原的降解，而膠原也是細(xì)胞成骨樣分化中的標(biāo)志蛋白之一。因此本研究旨在研究阿托伐他汀通過(guò)誘導(dǎo)自噬和影響TGFΒ1ΒCATENIN信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮抑制成骨樣分化的相關(guān)作用機(jī)制。方法本研究從細(xì)胞分子水平，考察TGFΒ1對(duì)VSMCS中ΒCATENIN表達(dá)和功能的影響以及對(duì)成骨樣分化標(biāo)志性蛋白表達(dá)的影響利用蛋白免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、小干擾RNA轉(zhuǎn)染以及激光共聚焦技術(shù)探討自噬及ΒCATENIN轉(zhuǎn)錄蛋白在TGFΒ1通路誘導(dǎo)成骨樣分化中的作用及信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。而且利用相關(guān)信號(hào)通路抑制劑，自噬抑制劑進(jìn)一步證實(shí)了阿托伐他汀在抑制TGFΒ1誘導(dǎo)的成骨樣分化中的作用機(jī)制。旨在為阿托伐他汀在血管退行性疾病中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)，為退行性血管病的防治提供新的靶點(diǎn)。結(jié)果1、阿托伐他汀抑制TGFΒ1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的成骨樣分化結(jié)果顯示TGFΒ1刺激細(xì)胞6、12、24、48、72小時(shí)，WESTERNBLOT結(jié)果證實(shí)TGFΒ1可促進(jìn)成骨樣分化標(biāo)志蛋白如Ⅰ型膠原TYPEⅠCOLLAGEN，骨形成蛋白（BMP2）和骨鈣素OSTEOCALCIN的蛋白水平表達(dá)增加并呈時(shí)間依賴性。然而，應(yīng)用阿托伐他汀預(yù)處理平滑肌細(xì)胞24小時(shí)后，與單獨(dú)TGFΒ1刺激組比較，鈣鹽沉積明顯減少，同樣觀察到在蛋白水平阿托伐他汀可使上述成骨樣分化標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯下降。2、阿托伐他汀通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制平滑肌細(xì)胞成骨樣分化21、在電鏡下觀察平滑肌細(xì)胞，結(jié)果顯示自噬泡在正常細(xì)胞中較少見(jiàn)。在TGFΒ1誘導(dǎo)的平滑肌成骨樣分化的過(guò)程中有少量的自噬泡形成。而當(dāng)采用阿托伐他汀預(yù)處理平滑肌細(xì)胞24小時(shí)繼而應(yīng)用相同濃度TGFΒ1，電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的自噬泡。應(yīng)用吖啶橙染色觀察自噬泡可以得到相同的結(jié)論。22、WESTERNBLOT結(jié)果顯示，阿托伐他汀可使自噬相關(guān)蛋白BECLIN1和ATG5的表達(dá)增加并呈時(shí)間依賴性。LC3ⅡLC3Ⅰ同樣也在阿托伐他汀預(yù)處理后較TGFΒ1組明顯升高。23、為了進(jìn)一步明確自噬與成骨樣分化的關(guān)系，利用自噬抑制劑3甲基腺嘌呤3MA在自噬過(guò)程中可抑制自噬泡AVS的形成。研究應(yīng)用3MA后發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制阿托伐他汀誘導(dǎo)的LC3ⅡLC3Ⅰ增高，同時(shí)阿托伐他汀發(fā)揮出的抑制成骨樣分化的作用也在應(yīng)用3MA后被減弱。3、阿托伐他汀通過(guò)下調(diào)ΒCATENIN表達(dá)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞自噬31、觀察ΒCATENIN在阿托伐他汀抑制TGFΒ1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞成骨樣分化中的作用。研究中觀察到TGFΒ1不僅可以使其經(jīng)典的PSMAD23發(fā)生核轉(zhuǎn)位，而且可使ΒCATENIN同樣發(fā)生核轉(zhuǎn)位。WESTERNBLOT結(jié)果顯示TGFΒ1可使ΒCATENIN呈時(shí)間依賴性的增高。32、研究TGFΒRI及ΒCATENIN在自噬和鈣化的作用，應(yīng)用TGFΒRI激酶抑制劑SD208或者ΒCATENIN抑制劑JW74均明顯加重TGFΒ1誘導(dǎo)自噬，但上述二者可減少TGFΒ1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞成骨樣分化。以上結(jié)果說(shuō)明TGFΒRI與ΒCATENIN參與TGFΒ1誘導(dǎo)的自噬和鈣化。33、為了進(jìn)一步明確阿托伐他汀誘導(dǎo)的自噬是否依賴于下調(diào)ΒCATENIN水平，采用阿托伐他汀預(yù)處理細(xì)胞，WESTERNBLOT結(jié)果顯示，阿托伐他汀可明顯降低TGFΒ1誘導(dǎo)的ΒCATENIN蛋白水平表達(dá)。為進(jìn)一步明確阿托伐他汀在TGFΒ1誘導(dǎo)的自噬和鈣化中的作用。利用重組蛋白WNT3A過(guò)表達(dá)ΒCATENIN進(jìn)而增加功能性ΒCATENIN水平。研究表明，WNT3A明顯增加ΒCATENIN表達(dá)，同時(shí)阿托伐他汀誘導(dǎo)的自噬可以被WNT3A明顯抑制。而阿托伐他汀對(duì)TGFΒ1誘導(dǎo)鈣化的抑制作用同樣可被WNT3A抵消。這些數(shù)據(jù)均表明ΒCATENIN在阿托伐他汀誘導(dǎo)自噬和抑制鈣化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。結(jié)論1、阿托伐他汀抑制TGFΒ1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的成骨樣分化。2、阿托伐他汀通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制平滑肌細(xì)胞成骨樣分化。3、阿托伐他汀通過(guò)下調(diào)ΒCATENIN表達(dá)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞自噬進(jìn)而發(fā)揮抑制成骨樣分化作用。