STAT-3信號通路在27-羥基膽固醇促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、21世紀(jì)乳腺癌已經(jīng)成為危害女性健康的重要因素，在女性腫瘤中占有相當(dāng)重要的地位。然而腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是乳腺癌發(fā)展過程和致死過程中的重要機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程復(fù)雜多樣，例如癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解細(xì)胞外基質(zhì)等等。眾多文獻(xiàn)報道細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可以使腫瘤細(xì)胞由多邊形、方形變?yōu)殚L梭形伴有上皮指標(biāo)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等下降、間質(zhì)指標(biāo)波形蛋白(Vimentin)、N-鈣黏蛋白(N-c

2、adherin)和E盒結(jié)合鋅指蛋白1(ZEB1)等上升而具有更強(qiáng)的運動遷移能力，是癌癥進(jìn)展的一個標(biāo)志;已有研究表明RECK(the reversion-inducing cysteine-rich proteinwith kazal motifs)蛋白可以通過下調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，因此在腫瘤發(fā)展過程中RECK表達(dá)的下調(diào)成為腫瘤惡轉(zhuǎn)的一個標(biāo)志。轉(zhuǎn)錄激活因子-3（STAT-3）的活化在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)

3、揮重要作用，可以激活下游侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)的表達(dá)。27-羥基膽固醇(27HC)是人體內(nèi)膽固醇的代謝產(chǎn)物，由細(xì)胞色素P450酶CYP27A1代謝產(chǎn)生，并由CYP7B1分解。高膽固醇血癥患者體內(nèi)27HC水平明顯升高;婦女尤其是絕經(jīng)后婦女肥胖導(dǎo)致膽固醇水平升高進(jìn)而催生27HC引發(fā)各種包括腫瘤在內(nèi)的疾病，嚴(yán)重危害人類健康。2013年Science報道，27HC可與ER受體結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及與LXR受體結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，但是目前關(guān)于27HC

4、能否通過下調(diào)腫瘤抑制基因RECK的表達(dá)從而影響STAT-3信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移尚未有報道。
　　目的:本研究以人ER陽性乳腺癌細(xì)胞系MCF7、T47D和人三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231為研究對象，探討27HC促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制及STAT-3在其中的作用，從而為腫瘤的預(yù)防及治療提供更多的實驗數(shù)據(jù)，打開新的思路。
　　方法:檢測27HC對細(xì)胞活力的影響:CCK8實驗;檢測27HC對乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能

5、力的影響:細(xì)胞劃痕實驗，預(yù)鋪matrigel膠和未鋪matrigel的Transwell實驗;檢測MMP2和MMP9的活性:明膠酶譜實驗;檢測目的基因的mRNA表達(dá)水平:RT-PCR和實時定量PCR（qRT-PCR）實驗;檢測基因的蛋白水平:蛋白質(zhì)免疫印跡實驗;si-RNA敲除RECK和STAT-3:細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗;檢測ROS:活性氧檢測實驗。
　　結(jié)果:
　　(1)27HC能夠促進(jìn)乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞的侵襲遷移能力:

6、首先，CCK8實驗和劃痕愈合實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)4.0μM是處理乳腺癌細(xì)胞72小時不影響細(xì)胞活力的最高濃度;采用預(yù)鋪膠和未鋪膠的Transwell實驗證實27HC能夠在不影響細(xì)胞活力的前提下，上調(diào)乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力;RT-PCR和qRT-PCR實驗結(jié)果顯示27HC可以呈劑量依賴性地上調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)MMP9的mRNA，但并不影響MMP2的mRNA水平;明膠酶譜實驗結(jié)果顯示27HC可以上調(diào)MMP9的活性，但并不影響MMP2的活性。另外，27H

7、C處理后，Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin下降，Vimentin和ZEB1上升。
　　(2)27HC下調(diào)RECK的蛋白水平和mRNA水平并上調(diào)MMP9的表達(dá)和活性:在分子機(jī)制探索研究中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過27HC處理后乳腺癌細(xì)胞的RECK的蛋白水平和mRNA均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，采用RECK siRNA干擾RECK蛋白表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)MMP9表達(dá)、活性及細(xì)胞侵襲能力上升，但是MMP2的表達(dá)和

8、活性不變。
　　(3)27HC可以通過ERα非依賴性途徑激活STAT-3信號通路進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力:另外，27HC處理ER陽性乳腺癌細(xì)胞MCF7和T47D及ER陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231后，p-STAT-3上升，STAT3信號通路被激活，GREB1的表達(dá)也上升，說明27HC也激活了經(jīng)典的ER信號通路。應(yīng)用siSTAT-3敲除STAT-3之后，27HC所引起的乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有所下降，其下游MMP9下降，

9、E-cadherin上升，Vimentin和ZEB1下降。表明STAT-3信號通路在27HC誘導(dǎo)的乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。
　　(4)27HC通過激活細(xì)胞內(nèi)ROS水平并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力:27HC和陽性參照H2O2處理ER陽性乳腺癌細(xì)胞MCF7和T47D后，加入碧云天ROS檢測試劑，并應(yīng)用熒光顯微鏡拍照，結(jié)果顯示27HC可以促進(jìn)ROS產(chǎn)生和蓄積，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激。
　　(5)27HC通過ROS引起甲基化導(dǎo)致

10、RECK的表達(dá)下調(diào)進(jìn)而激活STAT-3:27HC，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(AZA)，甲基供體(SAM)和陽性參照H2O2處理ER陽性乳腺癌細(xì)胞MCF7后，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合AZA處理后，27HC所引起的RECK下調(diào)有所逆轉(zhuǎn)，SAM處理后RECK的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢。采用RECK siRNA干擾RECK蛋白表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞內(nèi)p-STAT-3水平下降，STAT-3信號通路被阻斷。所以27HC通過ROS甲基化抑制RECK的表達(dá)進(jìn)而激活STAT-3最終正向調(diào)控乳

11、腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。另外采用STAT-3 siRNA干擾STAT-3后乳腺癌細(xì)胞內(nèi)RECK的mRNA水平上調(diào)。提示在這一過程中RECK與STAT-3信號通路存在相互作用關(guān)系。
　　結(jié)論:在人乳腺癌細(xì)胞中，27HC通過激活ROS，甲基化下調(diào)RECK的mRNA和蛋白水平進(jìn)而激活STAT-3信號通路，升高M(jìn)MP9的轉(zhuǎn)錄水平和活性以及導(dǎo)致EMT相關(guān)分子指標(biāo)E-cadherin下降、Vimentin和ZEB1上升，使乳腺癌細(xì)胞降解細(xì)胞外