RECK蛋白在異甘草素抑制乳腺癌細胞侵襲轉移中的作用.pdf

1、乳腺癌已經在世界范圍內成為導致女性人群死亡的主要因素，而腫瘤細胞的侵襲轉移是乳腺癌致死的重要原因。腫瘤細胞的侵襲轉移過程由多個步驟構成，其中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)降解細胞外基質在腫瘤細胞侵襲轉移的過程中發(fā)揮了重要作用。體內和體外實驗證據(jù)表明RECK蛋白可以通過負向調控MMP2和MMP9的功能進而抑制腫瘤細胞的侵襲轉移，而且在腫瘤進展過程中，RECK蛋白表達減少甚至丟失，因此在腫瘤細胞中

2、恢復RECK蛋白的表達對于抑制腫瘤細胞的侵襲轉移至關重要。異甘草素是從中草藥甘草中提取的一種植物化學物，目前已發(fā)現(xiàn)其具有抗炎和抗氧化等功能，但目前關于其能否通過上調腫瘤抑制基因RECK的表達抑制腫瘤細胞的侵襲轉移尚未有報道。
　　目的:
　　本研究以人三陰乳腺癌細胞系Hs-578T和MDA-MB-23I為研究對象，探討異甘草素抑制乳腺癌細胞侵襲轉移的機制及RECK蛋白在其中的作用，從而為腫瘤的膳食干預提供更多的實驗依據(jù)。

3、r>　　方法:
　　采用MTT實驗檢測細胞活力;采用預先鋪好matrigel的Transwell實驗檢測乳腺癌細胞的侵襲能力;采用明膠酶譜實驗檢測MMP2和MMP9的活性;采用RT-PCR和實時定量PCR實驗檢測基因的mRNA水平;采用實時定量PCR實驗檢測miR-21的表達水平;采用蛋白質印跡實驗檢測基因的蛋白水平;采用染色質免疫共沉淀實驗檢測stat3在miR-21啟動子區(qū)域的結合豐度;采用細胞瞬時轉染實驗敲除RECK和PIA

4、S3、高表達或低表達miR-21。
　　結果:
　　(1)異甘草素能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231和Hs-578T細胞的侵襲能力:首先，采用MTT實驗結果發(fā)現(xiàn)20.0和10.0μM分別是異甘草素處理乳腺癌細胞24和48小時不影響細胞活力的最高濃度;采用Transwell實驗證實異甘草素能夠在不影響細胞活力的前提下，下調乳腺癌細胞的侵襲能力;采用RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)異甘草素可以呈劑量依賴性和時間依賴性地下調乳腺癌細胞內MMP

5、9的mRNA，但MMP2的mRNA并未受影響;采用明膠酶譜實驗發(fā)現(xiàn)異甘草素可以下調MMP9的活性，同樣，MMP2的活性未受影響。
　　(2)異甘草素通過上調RECK的蛋白水平抑制MMP9:機制研究證據(jù)指出乳腺癌細胞經過異甘草素處理后RECK的蛋白水平上調，其mRNA水平未發(fā)生改變，而當使用RECK siRNA干擾異甘草素誘導的RECK蛋白高表達后，異甘草素對細胞內MMP9表達、活性及細胞侵襲能力的抑制作用被逆轉。
　　(3)

6、異甘草素通過抑制miR-21上調RECK的蛋白表達:實時定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)異甘草素可以呈劑量依賴性和時間依賴性地下調兩株乳腺癌細胞中miR-21的表達，并且當使用特異性抑制劑干擾細胞內miR-21的表達后，RECK的蛋白水平上調，mRNA未受影響。當在異甘草素處理的細胞中重新高表達miR-21后，異甘草素對RECK的誘導作用被抵消，并且細胞的侵襲能力也有一定的恢復。
　　(4)異甘草素下調stat3在miR-21啟動子區(qū)域的結合豐

7、度:染色質免疫共沉淀實驗及蛋白質印跡實驗結果證實異甘草素在磷酸化后水平降低轉錄因子stat3在miR-21啟動子區(qū)域的結合豐度。
　　(5)異甘草素通過上調PIAS3表達影響stat3在miR-21啟動子區(qū)域的結合豐度:蛋白質印跡實驗發(fā)現(xiàn)stat3的特異性抑制分子PIAS3在經過異甘草素處理的乳腺癌細胞中表達上調，當使用PIAS3 siRNA干擾異甘草素誘導的PIAS3高表達后，stat3在miR-21啟動子區(qū)域結合豐度及miR-