結(jié)節(jié)性硬化癥TSC1、TSC2基因突變分析及產(chǎn)前診斷.pdf

1、出生缺陷是指嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常，包括先天肢體或器官畸形、遺傳代謝缺陷、先天功能殘疾、免疫性疾病、智力低下等。其造成因素多種多樣，有遺傳因素、環(huán)境因素，或二者共同作用致病。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，孕產(chǎn)婦、兒童死亡率逐步降低，出生缺陷也日益成為突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題甚至是社會(huì)問(wèn)題。中國(guó)是人口大國(guó)，也是出生缺陷的高發(fā)國(guó)家之一，出生缺陷已成為影響中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育和出生人口健康素質(zhì)的重大問(wèn)題，也嚴(yán)重影響社會(huì)主義和諧社會(huì)的建設(shè)。它不僅是導(dǎo)

2、致早期自然流產(chǎn)、圍產(chǎn)兒死亡、嬰幼兒死亡以及先天殘疾的重要原因，也嚴(yán)重危害兒童的生存和生命質(zhì)量，影響家庭幸福，造成巨大的社會(huì)和家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。出生缺陷監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)出生缺陷總發(fā)生率約為5.6％（中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告，2012）。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球低收入國(guó)家的出生缺陷發(fā)生率為6.42％，中等收入國(guó)家為5.57％，高收入國(guó)家為4.72％，中國(guó)出生缺陷發(fā)生率與世界中等收入國(guó)家的平均水平接近，但由于人口基數(shù)大，每年新增出生缺陷病例總數(shù)龐大

3、。而產(chǎn)前診斷是杜絕和減少出生缺陷唯一有效的方法。
　　結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberous Sclerosis Complex，TSC)是一種較為常見的出生缺陷，其發(fā)病率約為1/6000-10000。中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤是導(dǎo)致死亡的主要原因，腎臟疾病為第二位原因。其臨床癥狀多變，從皮膚色素脫失斑，癲癇，智力低下，自閉癥，到腎臟、大腦、心臟、肺等器官的錯(cuò)構(gòu)瘤損害，嚴(yán)重程度無(wú)法預(yù)測(cè)。盡管有明確的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，但在實(shí)際應(yīng)用中仍具有一定困難。對(duì)于年

4、輕患者，尚缺乏典型的臨床癥狀，或者具有嚴(yán)重的臨床癥狀但缺乏特異性，如癲癇、智力低下、自閉癥，此時(shí)應(yīng)選擇基因檢測(cè)來(lái)確診。胎兒期雖可通過(guò)超聲心動(dòng)圖檢出心臟橫紋肌瘤，磁共振成像（MR工）檢出室管膜下結(jié)節(jié)，但該臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)間不確定，且影像學(xué)作為輔助檢查手段存在非特異性，往往不能得到確診結(jié)果。因此，產(chǎn)前診斷應(yīng)以基因檢測(cè)做為首選方法。TSC1、TSC2基因比較大，致病突變數(shù)量多且無(wú)突變熱點(diǎn)存在，基因檢測(cè)非常復(fù)雜。經(jīng)過(guò)40年的發(fā)展，測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了從

5、第一代到第三代的演變，通量和百萬(wàn)堿基測(cè)序費(fèi)用也越來(lái)越接近臨床的要求。圍繞速度、通量、價(jià)格這三個(gè)因素，一般將測(cè)序技術(shù)分為3代，而將第二、第三代測(cè)序技術(shù)統(tǒng)稱為新一代高通量測(cè)序技術(shù)。第一代核酸測(cè)序技術(shù)（Sanger測(cè)序法）檢測(cè)和分析過(guò)程非常耗費(fèi)人力、費(fèi)時(shí)、效率低。對(duì)電泳分離技術(shù)的依賴，使得該測(cè)序系統(tǒng)無(wú)法再進(jìn)一步擴(kuò)大通量和微量化。高通量測(cè)序高度平行化，即成千上萬(wàn)個(gè)測(cè)序反應(yīng)可以在一個(gè)平臺(tái)同時(shí)進(jìn)行，且反應(yīng)體系非常小，在很短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的堿基信息

6、，費(fèi)用也大大降低。
　　目的:對(duì)TSC先證者進(jìn)行基因突變檢測(cè)，并在基因診斷結(jié)果明確的基礎(chǔ)上應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。
　　方法:對(duì)臨床確診、可疑TSC的患者或產(chǎn)前超聲異?？梢蒚SC的胎兒共13個(gè)家系，采用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)TSC相關(guān)基因(TSC1、TSC2)外顯子及其上下游10bp的非編碼區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，確定基因突變位點(diǎn)。在突變位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，采用Sanger測(cè)序法對(duì)先證者及其家系成員進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，分析突變來(lái)源，并復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，最后對(duì)患

7、病家系行相應(yīng)基因突變位點(diǎn)的產(chǎn)前診斷。產(chǎn)前診斷結(jié)果為陰性的家系，胎兒娩出后行臍血相應(yīng)基因突變位點(diǎn)Sanger測(cè)序，以驗(yàn)證產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果:13個(gè)家系均檢出基因突變，其中1例TSC1基因突變，12例TSC2基因突變，已知致病突變10例，新發(fā)可疑致病突變3例。12個(gè)家系行產(chǎn)前診斷，其中陽(yáng)性2例，陰性10例，陽(yáng)性病例夫婦最終決定終止妊娠，陰性病例胎兒娩出后臍血相應(yīng)基因突變位點(diǎn)測(cè)序與產(chǎn)前一致。
　　結(jié)論:TSC2基因c.2

8、415-2416insGT、c.3981-3982insA、c.4013-4014delCA為新發(fā)可疑致病突變，均為TSC2的框移突變，不僅豐富了TSC基因突變譜，而且給突變蛋白細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的進(jìn)一步驗(yàn)證提供了資料。且成功對(duì)12個(gè)TSC家系行產(chǎn)前基因診斷，基因位點(diǎn)包括TSC1基因c.2074C＞T，TSC2基因c.1832G＞C、c.5227C＞T、c.2713C＞T、c.2415-2416insGT、c.3352C＞T、c.401