結(jié)節(jié)性硬化癥中主動脈瘤形成的發(fā)病機制研究.pdf

1、研究背景：在美國每年死于胸主動脈瘤/夾層(TAAD)的患者約16000人，大約20％的TAAD患者具有遺傳傾向。至今，已證實5個基因與TAAD有關(guān)聯(lián)。平滑肌細胞特異性收縮蛋白α-肌動蛋白(ACTA2)和肌球蛋白重鏈蛋白(MYH11)突變占家族性TAAD病因的15％。一些證據(jù)提示，TAAD起因于主動脈平滑肌細胞收縮功能受損：在ACTA2和MYH11突變患者，所有的突變均導(dǎo)致氨基酸序列改變，最終引起收縮蛋白功能改變；其次，有研究發(fā)現(xiàn)，心臟特

2、異性肌動蛋白和肌球蛋白突變能導(dǎo)致肥厚型心肌病；骨骼肌肌動蛋白突變能導(dǎo)致三種骨骼肌肌病；MYH11基因敲除鼠存活不超過72小時，ACTA2基因敲除鼠，雖然能夠存活，但是血管收縮功能顯著下降。這些研究顯示，TAAD的發(fā)生可能歸因于平滑肌細胞功能受損，特別是收縮功能受限。但是引起平滑肌細胞功能受限的分子機制，目前仍不清楚。在此基礎(chǔ)上，本課題借助于TSC2+/-模型鼠，分析主動脈平滑肌細胞生物學(xué)行為，探討一種特殊類型的主動脈瘤發(fā)病機制。

3、　　 方法：對一例結(jié)節(jié)性硬化癥(TSC)合并胸主動脈瘤患者進行基因組測序，病變主動脈免疫組化染色分析主動脈結(jié)構(gòu)變化。利用TSC2+/-雜合子鼠模擬胸主動脈瘤發(fā)病機制，分別培養(yǎng)升主動脈和降主動脈平滑肌細胞，應(yīng)用BrdU方法檢測細胞增殖水平，分別檢測雜合子鼠和對照組鼠平滑肌細胞的細胞周期，熒光半定量RT-PCR方法檢測細胞收縮蛋白基因表達，免疫熒光化學(xué)染色分析細胞內(nèi)肌絲分布變化，蛋白印跡方法(westernblot)檢測細胞內(nèi)收縮蛋白水平

4、以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的變化。將兩組細胞分別用mTOR抑制劑雷帕霉素處理，比較上述結(jié)果的前后變化。
　　 結(jié)果：TSC合并胸主動脈瘤患者存在一種罕見的TSC2基因突變，其主動脈平滑肌細胞增殖紊亂、彈力纖維減少、膠原纖維增加。TSC2+/-雜合子鼠平滑肌細胞增殖顯著快于野生型鼠，且降主動脈平滑肌細胞增殖快于升主動脈平滑肌細胞(P<0.01)。細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)TSC2+/-鼠平滑肌細胞多數(shù)處于S期和G2/M期(P

5、<0.01)。熒光半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，TSC2+/-鼠平滑肌細胞與對照組相比，ACTA2、MYH11、鈣調(diào)蛋白(CNN1)基因表達均顯著降低，而S100A4基因表達顯著升高。免疫熒光化學(xué)染色顯示，在TSC2+/-鼠平滑肌細胞內(nèi)，α-肌動蛋白肌絲減少及分布改變。Western blot分析提示，雜合子鼠平滑肌細胞內(nèi)收縮蛋白表達均下降，且mTOR通路被激活。應(yīng)用雷帕霉素處理后，平滑肌細胞增殖顯著抑制，且細胞周期阻滯在G0/G1期，收縮蛋