金黃色葡萄球菌RNase Ⅲ的催化機(jī)理研究和動(dòng)粒蛋白Mis12復(fù)合物與相關(guān)蛋白的相互作用研究.pdf

1、雙鏈RNA（dsRNA）可由初級(jí)轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)配對(duì)產(chǎn)生，在細(xì)胞中廣泛存在，并發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。而且，dsRNA也是許多病毒的遺傳物質(zhì)。在細(xì)菌和真核細(xì)胞中，RNaseⅢ家族（核糖核酸內(nèi)切酶Ⅲ）的成員選擇性地識(shí)別和剪切dsRNA，在基因表達(dá)和調(diào)控，宿主防御和基因組監(jiān)控等過程中扮演著重要的角色。RNaseⅢ家族成員對(duì)dsRNA的加工是編碼RNA和非編碼RNA成熟和衰變過程中的關(guān)鍵步驟，甚至在miRNA和siRNA的生成中也起著重要作用。RNas

2、eⅢ是二價(jià)金屬離子依賴的磷酸二酯酶。RNaseⅢ家族成員有一個(gè)獨(dú)特的RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域，以二聚體形式發(fā)揮其酶活，結(jié)合dsRNA，并剪切每條鏈上的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生一個(gè)特征性的3'端有2個(gè)核苷酸突起的產(chǎn)物。
　　為了了解金黃色葡萄球菌RNaseⅢ與其他細(xì)菌RNaseⅢ之間的異同，我們解析了金黃色葡萄球菌RNaseⅢ的晶體結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行了分析。我們發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌RNaseⅢ與其他細(xì)菌RNaseⅢ整體結(jié)構(gòu)相似，兩個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域

3、通過疏水作用形成緊密的二聚體，同時(shí)參與金屬離子配位的活性中心關(guān)鍵氨基酸殘基也是保守的。通過體外酶活實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn):金黃色葡萄球菌RNaseⅢ在二價(jià)金屬離子條件下催化dsRNA底物的水解;不同二價(jià)金屬離子對(duì)金黃色葡萄球菌RNaseⅢ催化效率的影響有差異，相對(duì)于Mg2+，Mn2+條件下Sa-RNaseⅢ有更強(qiáng)的催化活性，Ca2+和Ni2+則會(huì)抑制其活性。而活性中心關(guān)鍵氨基酸殘基的突變會(huì)大大減弱Sa-RNaseⅢ的催化活性。
　　動(dòng)粒是

4、一個(gè)大的蛋白網(wǎng)絡(luò)，在有絲分裂時(shí)期陸續(xù)組裝到著絲粒染色體上。它連接姐妹染色單體和紡錘體微管，促進(jìn)姐妹染色單體準(zhǔn)確分離到紡錘體的兩極。動(dòng)粒主要由內(nèi)層的CCAN蛋白網(wǎng)絡(luò)和外層的KMN蛋白網(wǎng)絡(luò)組成。KMN蛋白網(wǎng)絡(luò)主要由Knl1，Mis12復(fù)合物及Ndc80復(fù)合物組成。Mis12復(fù)合物是連接內(nèi)外層動(dòng)粒的橋梁，它與CENP-C發(fā)生相互作用而被招募至動(dòng)粒，又通過與Knl1和Ndc80復(fù)合物的相互作用，招募其它外層動(dòng)粒組分，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)粒和微管的連接。盡

5、管關(guān)于外層動(dòng)粒的研究很多，到目前為止，KMN蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)Mis12復(fù)合物與Ndc80復(fù)合物相互作用的具體方式和調(diào)節(jié)機(jī)制還不是很清楚。在減數(shù)分裂Ⅰ期，姐妹染色單體的動(dòng)粒結(jié)合到來(lái)自同一方向紡錘體的微管，稱為單極定向。在釀酒酵母中，單極定向主要依賴于四亞基的monopolin復(fù)合物。Monopolin復(fù)合物在減數(shù)分裂Ⅰ期結(jié)合到姐妹染色單體的動(dòng)粒上，并促進(jìn)單極定向。然而目前monopolin復(fù)合物在動(dòng)粒上的結(jié)合位點(diǎn)以及發(fā)揮作用的機(jī)制還不是很清楚。

6、有研究發(fā)現(xiàn)，monopolin復(fù)合物亞基Csm1可能通過與MIND復(fù)合物（人源Mis12復(fù)合物在釀酒酵母中的同源物）亞基Dsn1相互作用，而將姐妹動(dòng)粒機(jī)械融合，從而促進(jìn)姐妹染色單體的單極定向。
　　我們嘗試通過體外重組表達(dá)的方法，來(lái)獲得純度較高的人源Mis12復(fù)合物亞基Dsn1和Nsl1的截短體與人源和裂殖酵母中的Ndc80bonsai蛋白，并嘗試通過體外pull-down方法檢測(cè)人源和裂殖酵母兩個(gè)物種中Ndc80復(fù)合物與Mis1