SIRT6在胃癌中的表達(dá)變化及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　胃癌作為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其死亡數(shù)量約占所有癌癥死亡人數(shù)的8％。我國(guó)是胃癌的高發(fā)國(guó)家，胃癌患者的五年生存率不到20％。盡管新型綜合治療模式如介入治療、分子靶向治療的應(yīng)用可在一定程度上改善胃癌患者的預(yù)后，提高其生存率，但臨床隨訪調(diào)查顯示胃癌患者仍有著較高的死亡率。伴隨分子生物學(xué)的發(fā)展，人們?nèi)諠u認(rèn)識(shí)到轉(zhuǎn)錄信號(hào)分子及其相關(guān)調(diào)控因子在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著重要作用，因此尋找胃癌進(jìn)展過(guò)程中調(diào)控因子，明確其可能的作用機(jī)制和途徑

2、，對(duì)改善胃癌預(yù)后，提高患者生存率有著重要意義。
　　Sirtuin是NAD+依賴型第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)，廣泛分布于機(jī)體中[1]。研究證實(shí)Sirtuin蛋白可通過(guò)調(diào)控基因穩(wěn)定性及腫瘤細(xì)胞能量代謝、改變腫瘤微環(huán)境等多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖分化遷移。SIRT6作為Sirtuin蛋白中的一員，體外及臨床研究顯示它可能具有一定的抑癌作用，查閱The Cancer Genome Atla

3、s數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示約20％腫瘤患者可出現(xiàn)SIRT6表達(dá)缺失，但也有研究認(rèn)為在胰腺癌及乳腺癌中SIRT6具有致瘤作用。目前對(duì)SIRT6在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的可能作用尚無(wú)明確定論，關(guān)于SIRT6在腫瘤發(fā)生發(fā)展中基礎(chǔ)性及應(yīng)用性研究較為匱乏，尤其是SIRT6在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用仍是空白，因此需進(jìn)一步的探討。
　　“Warburg效應(yīng)”作為腫瘤細(xì)胞能量代謝的主要特征，表現(xiàn)為有氧糖酵解、脂肪酸合成及谷氨酰胺分解能力的增強(qiáng)，以保證腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增

4、殖遷移等過(guò)程中必需的物質(zhì)和能量的供應(yīng)。研究認(rèn)為“Warburg效應(yīng)”的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種抑癌因子及原癌因子表達(dá)水平密切相關(guān)，這些抑癌因子及原癌因子參與了腫瘤細(xì)胞代謝途徑的再編程。SIRT6作為機(jī)體代謝功能的關(guān)鍵調(diào)控因子，特異性敲除肝臟SIRT6可導(dǎo)致小鼠糖酵解能力的增強(qiáng)，線粒體呼吸能力減弱，證實(shí)SIRT6對(duì)機(jī)體代謝功能的調(diào)控作用與抑制糖酵解，促進(jìn)氧化磷酸化，維持機(jī)體糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible f

5、actor-1α，HIF-1α)是細(xì)胞代謝途徑轉(zhuǎn)換過(guò)程中重要的調(diào)控因子，其可影響多種糖酵解相關(guān)酶如PFK1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter1，Glut1)等表達(dá)，研究顯示SIRT6缺陷小鼠退行性變化與HIF1α介導(dǎo)的代謝途徑轉(zhuǎn)換有關(guān)。由此我們推測(cè)SIRT6可通過(guò)影響HIF-1α表達(dá)調(diào)控Warburg效應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞分化增殖活性的調(diào)控。因此本研究擬探討SIRT6在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能作用展開(kāi)研究:1.明

6、確胃癌患者病灶組織及癌旁正常組織中SIRT6和HIF-1α表達(dá)水平，分析其與胃癌患者臨床特征的相關(guān)性;2.明確胃癌患者病灶組織及癌旁正常組織中糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)水平，分析其與SIRT6和HIF-1α表達(dá)水平相關(guān)性;3.構(gòu)建SIRT6過(guò)表達(dá)SGC7901細(xì)胞，分析SIRT6過(guò)表達(dá)后SGC7901糖酵解的變化情況，明確其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.SIRT6及HIF-1α在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)
　　選取20

7、13-2015年間，在山東省立醫(yī)院東院消化內(nèi)科接受診斷及治療、病理學(xué)確診為胃癌的患者標(biāo)本共40例，設(shè)置對(duì)照組和病灶組，對(duì)照組取胃癌病灶周邊健康胃組織，采集時(shí)對(duì)照組樣本與癌組織距離不得小于5 cm;病灶組為胃癌組織。免疫組化技術(shù)檢測(cè)胃癌病灶組織中SIRT6及HIF-1α的分布及表達(dá)，RT-PCR和Western-blot法測(cè)定SIRT6及HIF-1α表達(dá)情況，分析其與胃癌患者臨床特征指標(biāo)的相關(guān)性。
　　2.胃癌組織及癌旁組織糖酵解水

8、平及與SIRT6、HIF-1α相關(guān)性分析
　　RT-PCR法測(cè)定胃癌組織及癌旁正常組織糖酵解相關(guān)代謝酶HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)水平，分析SIRT6及HIF-1α與HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　3.SIRT6對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901糖代謝功能的影響及機(jī)制探討
　　利用胃癌細(xì)胞株SGC7901建立SIRT6過(guò)表達(dá)模型(pSIRT6)，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA

9、3.1(+)空載體設(shè)為對(duì)照組(pVector)，測(cè)定SIRT6過(guò)表達(dá)SGC7901細(xì)胞株的增殖活性，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，明確SIRT6過(guò)表達(dá)SGC7901細(xì)胞糖攝入及乳酸分泌能力，Western-blot法分析SIRT6過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)水平，RT-PCR法測(cè)定HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化檢測(cè)胃癌患者病灶組織及癌旁正常組織內(nèi)HIF-1α及SIRT

10、6表達(dá)結(jié)果顯示，HIF-1α及SIRT6主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，胃癌患者組織中SIRT6陽(yáng)性率明顯低于癌旁正常組織組;與癌旁正常組織相比，胃癌患者組織內(nèi)HIF-1α陽(yáng)性率明顯增高（P＜0.05）;與癌旁正常組織相比，胃癌患者病灶組織內(nèi)SIRT6 mRNA及蛋白表達(dá)水平表現(xiàn)為不同程度的降低，而HIF-1α的表達(dá)水平則明顯上調(diào)(P＜0.05)。
　　2.HIF-1α表達(dá)水平與胃癌患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理分級(jí)、臨床TNM分期及浸潤(rùn)

11、深度相關(guān)，但與患者年齡、性別無(wú)相關(guān)性;SIRT6表達(dá)水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理分級(jí)、臨床TNM分期及浸潤(rùn)深度相關(guān)，但與患者年齡、性別及腫瘤大小無(wú)相關(guān)性。
　　3.Pearson correlation分析顯示胃癌組織中HIF-1α與SIRT6表達(dá)密切相關(guān)(P＜0.05)。
　　4.40例胃癌患者中HK、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)上調(diào)病例數(shù)分別為27例、25例、29例和29例，占所有病患人數(shù)的67.5

12、％、62.5％、72.5％和72.5％，與癌旁正常組織相比，病灶組織內(nèi)HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);Pearson correlation分析顯示SIRT6與HK2、PDK1、LDH5和Glut1mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性，其R2值分別為0.6493、0.4082、0.6169和0.2667(P＜0.05); HIF-1α與HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)水平呈正相

13、關(guān)性，其R2值分別為0.3717、0.3075、0.5025和0.1892(P＜0.05)。
　　5.SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)SIRT6質(zhì)粒建立SIRT6過(guò)表達(dá)模型，CCK-8試劑盒分析SIRT6過(guò)表達(dá)SGC7901細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示SIRT6過(guò)表達(dá)后可抑制SGC7901細(xì)胞的增殖活性，而pVector組和Parental組內(nèi)SGC7901細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯差別。
　　6.TUNEL法分析SIRT6過(guò)

14、表達(dá)后SGC7901細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示pVector和Parental組內(nèi)未檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，pSIRT6組內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)為32.60±2.54，與pVector和Parental組相比pSIRT6組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P＜0.05)。
　　7.SIRT6過(guò)表達(dá)后SGC7901細(xì)胞的葡萄糖利用能力減弱，與pVector和Parental組相比，培養(yǎng)上清液中葡萄糖的相對(duì)含量增加(P＜0.05)。乳酸作為衡量糖酵解活性的關(guān)鍵指標(biāo)，

15、SIRT6過(guò)表達(dá)后SGC7901細(xì)胞中乳酸合成能力降低(P＜0.05)，上清液中乳酸含量明顯減少，表明SIRT6過(guò)表達(dá)可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞糖酵解能力。
　　8.SIRT6過(guò)表達(dá)后，SGC7901細(xì)胞中HK2、LDH5和Glut1mRNA表達(dá)水平均發(fā)生不同程度的下調(diào)(P＜0.05)，但PDK1表達(dá)水平卻未發(fā)生明顯改變，提示SIRT6過(guò)表達(dá)后可通過(guò)影響糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對(duì)糖酵解途徑的調(diào)控。
　　9.Western

16、-blot法分析SIRT6過(guò)表達(dá)SGC7901細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)水平，與pVector和Parental組相比，SIRT6過(guò)表達(dá)SGC7901細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.胃癌組織中SIRT6陽(yáng)性率明顯低于癌旁組織組，SIRT6表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理分級(jí)、臨床TNM分期及浸潤(rùn)深度相關(guān)，但與患者年齡、性別及腫瘤大小無(wú)相關(guān)性。胃癌組織中HIF-1α陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織組，

17、與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理分級(jí)、臨床TNM分期及浸潤(rùn)深度相關(guān)，但與患者年齡、性別無(wú)相關(guān)性。Pearson correlation分析結(jié)果證實(shí)胃癌組織中HIF-1α與SIRT6表達(dá)水平密切相關(guān)。
　　2.胃癌患者病灶組織內(nèi)HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。SIRT6與HK2、PDK1、LDH5和Glut1mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性。HIF-1α與HK2、PDK1、LDH5和Glut1