MACF1在胃癌中的表達及CRISPR-Cas9敲除MACF1對胃癌體外生物學行為的影響.pdf

1、胃癌(gastric cancer, GC)是全球死亡率第二位的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)病率高，治療效果差，根治率低，在消化道腫瘤中發(fā)病率和死亡率占第一位，是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一。
　　本研究擬探討MACF1在胃癌中的表達情況及預后的關(guān)系，為胃癌的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。并采用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，敲除胃癌細胞系中的MACF1基因的表達，觀察細胞生物學行為及功能的變化，從而研究MACF1在胃癌發(fā)生發(fā)展機制中的

2、作用。
　　本研究主要分為以下三個部分:
　　第一部分：MACF1在胃癌中的表達情況及與臨床預后之間的關(guān)系
　　目的：
　　探討MACF1蛋白在胃癌組織中的表達情況及其與臨床病理學特征和臨床預后之間的關(guān)系
　　方法：
　　1.構(gòu)建組織芯片并采用免疫組化法(IHC)檢測MACF1在107例胃癌組織及107例相對應(yīng)正常組織的胃癌上皮中的表達情況;
　　2.對所有患者進行隨訪，獲得5年隨訪資料，并結(jié)合

3、MACF1在胃癌上皮組織中的表達情況，分析MACF1表達與臨床病理和預后之間的關(guān)系;
　　3.免疫組化結(jié)果分析和判定:每張芯片免疫組化結(jié)果均由3位病理科醫(yī)師進行雙盲評價，芯片上的每個點評價至少5個高倍視野，每個高倍視野下的細胞不應(yīng)少于100個。然后根據(jù)免疫組化的著色強度和著色范圍進行綜合評價。
　　4.統(tǒng)計學處理:應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進行處理。采用Spearman相關(guān)分析進行有序變量之間的聯(lián)系的分析

4、，采用Pearson's卡方檢驗分類變量之間的比較;采用Kaplan-Meier法分析MACF1表達與胃癌患者生存預后之間的關(guān)系并繪制生存曲線，采用log-rank檢驗比較組間的差異;采用Cox風險模型進行多因素分析，評估各個指標對患者的預后生存的獨立影響，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等等，從而分析與胃癌患者預后生存相關(guān)的獨立危險因素。P＜0.05時有統(tǒng)計學差異，雙側(cè)檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.

5、免疫組化結(jié)果顯示:在107例胃癌癌旁正常組織中，24例染色陽性(22.4％)，83例染色陰性(77.6％);107例胃癌組織中，76例染色陽性(71.0％)，31例染色陰性(29.0％)。MACF1蛋白在胃癌組織中的表達率為71％(76/107)，明顯高于其相應(yīng)的癌旁正常胃粘膜組織22.4％(24/107)，且差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);
　　2.MACF1過表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)和腫瘤分期密切相關(guān)，并有統(tǒng)計學意義(

6、p＜0.05);
　　3.總體胃癌術(shù)后患者5年生存生存率42.5％(45/107)，MACF1蛋白表達升高的胃癌患者的5年生存率35.2％(25/76)明顯低于MACF1蛋白低表達的胃癌患者的5年生存率55.6％(20/31)，且差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.034);
　　4.MACF1的過表達、臨床分期、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移個數(shù)都是胃癌患者術(shù)后總體生存率的獨立預后因素。
　　第二部分：CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1

7、基因改造胃癌細胞系
　　目的：
　　探討MACF1在不同胃癌細胞系中的表達情況及并利用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)靶向敲除MACF1以獲得突變型胃癌細胞系。
　　方法：
　　1.采用熒光實時定量PCR(Q-PCR)和蛋白印跡(Western-blot)的方法檢測MACF1在5個不同的胃癌細胞系A(chǔ)GS、HGC-27、SNU-1、KATO-Ⅲ、NCI-N87中的表達情況，篩選表達量較高的細胞系;
　　2.

8、MACF1 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建:將MACF1的全基因組序列輸入Vector NTI軟件中，選定合適外顯子并在Zifit工具網(wǎng)站中獲取合適的sgRNA序列，并加入BsaⅠ酶切位點，CRISPR/Cas9及引導的sgRNA轉(zhuǎn)染目的細胞后，Cas9在切割基因組的同時也會切割同樣含有靶序列的質(zhì)粒reporter，將sgRNA和reporter合成后，稀釋退火，連接轉(zhuǎn)化、挑菌、擴大培養(yǎng)，質(zhì)粒提取;
　　3.通過轉(zhuǎn)染EGFP綠色熒

9、光蛋白，篩選轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與Lip2000的最佳轉(zhuǎn)染比例:質(zhì)粒的質(zhì)量與Lip2000體積比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，轉(zhuǎn)染48小時后觀察細胞轉(zhuǎn)染情況，選取最佳轉(zhuǎn)染比例;
　　4.使用Lip2000分別將sgRNA、reporter、cas9轉(zhuǎn)染進JH293工具細胞，篩選切割效率較高的sgRNA;
　　5.使用Lip2000分別將切割效率較高的sgRNA、reporter、cas9轉(zhuǎn)染進工具細胞目的細胞AGS、S

10、NU-1，48小時后觀察轉(zhuǎn)染效率;
　　6.流式分選細胞儀分選目的細胞:將轉(zhuǎn)染后細胞消化制備單細胞懸液，在流式細胞儀中分選單個目的細胞，種于96孔板中;
　　7.單克隆細胞的培養(yǎng)及細胞收集:培養(yǎng)1-2周后，觀察96孔板中的單克隆細胞團，待96孔板中的細胞長至50％左右時，分至另一96孔板中。
　　結(jié)果：
　　1.Q-PCR和Western-blot結(jié)果顯示: MACF1在5個不同的胃癌細胞系A(chǔ)GS、HGC-27、

11、SNU-1、KATO-Ⅲ、NCI-N87等均有表達，且Q-PCR與WB二者結(jié)果基本一致，均為NCI-N87表達量最高，其次為AGS、SNU-1、HGC-27、KATO-Ⅲ;
　　2.成功構(gòu)建MACF1 CRISPR/Cas9載體，共構(gòu)建5個sgRNA、2個reporter，并轉(zhuǎn)化、搖菌、擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒;
　　3.質(zhì)粒與Lip2000最佳轉(zhuǎn)染比例分別為:AGS1∶2、HGC-271∶2、SNU-11∶3、KATO-Ⅲ1∶3

12、、NCI-N87的Lip2000轉(zhuǎn)染效率極低;
　　4.JH293工具細胞篩選的sgRNA和reporter分別為reporter1、sgRNA2;
　　5.成功將sgRNA2和reporter1轉(zhuǎn)染進入AGS和SNU-1，48小時后流式分選
　　6.流式分選AGS和SNU-1的單細胞懸液，種于96孔板中，每個細胞分別收集4個96孔板;
　　7.單克隆細胞團形成后，并長成96孔板的50％，分盤培養(yǎng)，AGS細胞平均

13、單克隆形成率為19/96(19.79％)，SNU-1細胞平均單克隆形成率為25/96(25.78％)。AGS細胞存活率48.68％; SNU-1細胞存活率46.46％。
　　8.T7錯配酶切鑒定:37個AGS細胞株有10個酶切鑒定結(jié)果為陽性，陽性率27％; SNU-1共驗證8株，其中7個鑒定結(jié)果為陽性，陽性率為87.5％;將陽性的AGS和SNU-1全部送測序。
　　9.DNA測序并篩選AGS野生細胞系2株，純合突變（正負）2

14、株，雜合突變（負負）5株;SNU野生細胞系2株，一條染色體敲除細胞系2株，兩條染色體同時敲除細胞系6株;
　　10.Western-blot驗證得到的細胞株，MACF1基因純合突變細胞系蛋白表達缺失，MACF1雜合突變細胞系蛋白表達較MACF1野生型減少。
　　第三部分：MACF1基因敲除對胃癌AGS細胞系體外生物學行為的影響
　　目的：
　　探討CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1基因后對胃癌AGS細胞系生

15、物學行為的影響。
　　方法：
　　1.MTS法檢測敲除MACF1對胃癌AGS細胞增殖能力的影響;
　　2.細胞劃痕實驗檢測敲除MACF1對胃癌AGS細胞的遷移能力的影響;
　　3.平板克隆檢測敲除MACF1對胃癌AGS細胞的克隆形成能力的影響;
　　4.軟瓊脂克隆形成檢測敲除MACF1對胃癌AGS細胞的克隆形成能力的影響;
　　5.Transwell實驗檢測敲除MACF1對胃癌AGS細胞的遷移能力的影

16、響;
　　6.流式細胞儀檢測敲除MACF1對胃癌AGS細胞周期的影響。
　　結(jié)果：
　　1.MACF1敲除后的胃癌AGS細胞形態(tài)變化，梭形變?yōu)轭悎A形;
　　2.MTS結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細胞增殖能力減弱;
　　3.細胞劃痕實驗結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細胞增殖能力減弱;
　　4.平板克隆形成實驗結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌細胞克隆形成能力減弱;
　　5.軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)

17、果顯示MACF1敲除后胃癌細胞克隆形成能力減弱;
　　6.Transwell結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細胞的遷移能力減弱;
　　7.流式結(jié)果顯示MACF1敲除后細胞阻滯在G2/M有絲分裂期。
　　結(jié)論：
　　1.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表達可以使胃癌細胞形態(tài)變化，細胞極性消失，形態(tài)由梭形變?yōu)轭悎A形，可能與MACF1蛋白參與細胞骨架形成有關(guān);
　　2.CRISPR/Cas9敲除MAC