利用CRISPR-Cas9敲除內(nèi)源性TRAC基因的研究.pdf

1、目的：針對(duì)TCRαC區(qū)設(shè)計(jì)出三個(gè)CRISPR靶向編輯位點(diǎn)，對(duì)這三個(gè)編輯位點(diǎn)進(jìn)行篩選，找出編輯效果較好的質(zhì)粒并對(duì)其脫靶率進(jìn)行評(píng)估?？疾霤RISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)人源的不同類型的細(xì)胞系的基因編輯情況，并初步探尋人源不同類型細(xì)胞的基因修復(fù)機(jī)制。針對(duì)CRISPR-Cas9-TRAC系統(tǒng)構(gòu)建相應(yīng)的腺病毒載體，為后續(xù)對(duì)于人源T細(xì)胞TCR基因的編輯奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、CRISPR-Cas9-TRAC系統(tǒng)的構(gòu)建及功能、脫靶率的評(píng)

2、估
　　利用 CRISPR網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/）提供的靶向編輯位點(diǎn)篩選工具，針對(duì)TCRαC區(qū)設(shè)計(jì)出3個(gè)基因編輯位點(diǎn)，并構(gòu)建CRISPR-Cas9-TCR系統(tǒng)，通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞系中，利用流式細(xì)胞術(shù)法和PCR結(jié)合T-A克隆測(cè)序等方法篩選出編輯效果較好的質(zhì)粒并驗(yàn)證其編輯效率。然后，利用脫靶在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/；https://chopchop.rc.

3、fas.harvard.edu/index.php；http://cas9.cbi.pku.edu.cn/；http://gt-scan.braembl.org.au/gt-scan/submit），預(yù)測(cè)其潛在的脫靶位點(diǎn)，綜合選取分值較高的10個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)出相應(yīng)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，檢測(cè)其是否存在脫靶現(xiàn)象。
　　二、CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)不同細(xì)胞系基因編輯情況的對(duì)比
　　為進(jìn)一步分析不同細(xì)胞的基

4、因修復(fù)系統(tǒng)是否存在差異，將篩選出的具有較好編輯效率的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不同類型的人源細(xì)胞（包括腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞），檢測(cè)其對(duì)不同細(xì)胞的基因組編輯情況。同時(shí)對(duì)參與NHEJ修復(fù)的基因（Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Ligase4、XRCC4、XLF、APTX、PNKP、APLF、TdP1、TdP2、Artemis、Metnase、WRN、Mre11、pol、pol、TDT）進(jìn)行表達(dá)分析，對(duì)這些修復(fù)基因在人源不同類型細(xì)胞的表達(dá)中是否存在差異性

5、進(jìn)行初步的考察。
　　三、CRISPR-Cas9系統(tǒng)的腺病毒載體構(gòu)建及條件優(yōu)化
　　為了以后進(jìn)一步探究CRISPR-Cas9-TCR系統(tǒng)對(duì)于T細(xì)胞的基因編輯情況，基于以往工作基礎(chǔ)，首先需要將CRISPR-Cas9-TCR系統(tǒng)進(jìn)行腺病毒載體的構(gòu)建，以利用腺病毒作為載體將 CRISPR-Cas9-TCR系統(tǒng)轉(zhuǎn)入 T細(xì)胞內(nèi)。將pX330的U6+gRNA區(qū)段和Cas9基因區(qū)段分別連入pDC315載體構(gòu)建穿梭質(zhì)粒，以便將來分別進(jìn)行重組

6、腺病毒的包裝。其中，U6+gRNA是通過PCR擴(kuò)增的方法得到，同時(shí)在兩端引入EcoRI和XbaI的酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增得到的目的片段與T載體連接構(gòu)建出過渡質(zhì)粒，再通過對(duì)pDC315和過渡質(zhì)粒的酶切（EcoRI、XbaI）、連接的系列反應(yīng)構(gòu)建得到pDC315-U6+gRNA腺病毒穿梭質(zhì)粒；在構(gòu)建pDC315-Cas9的過程中，通過對(duì)pDC315質(zhì)粒的系列改造，在其多克隆位點(diǎn)添加AgeI酶切位點(diǎn)，進(jìn)而達(dá)到能夠與Cas9片段進(jìn)行粘末端連接的目的。

7、將改造后的pDC315和pX330分別進(jìn)行一系列酶切（AgeI、EcoRI、XbaI）、連接等反應(yīng)構(gòu)建出pDC315-Cas9腺病毒穿梭質(zhì)粒。
　　結(jié)果：
　　一：CRIPSPR-Cas9-TRAC質(zhì)粒構(gòu)建成功，并完成功能驗(yàn)證及脫靶率檢測(cè)
　　基于pX458質(zhì)粒，將針對(duì) TRAC設(shè)計(jì)的三個(gè)靶位點(diǎn)分別構(gòu)建出敲除質(zhì)粒（pX458-site1、pX458-site2、pX458-site3），將這三種質(zhì)粒利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別

8、導(dǎo)入293T細(xì)胞系，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)這三種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率：pX458-site1為38.4％，pX458-site2為30.5%，pX458-site3為37.8%。轉(zhuǎn)染72h后對(duì)這三組細(xì)胞分別提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增以及PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序，可知pX458-site2質(zhì)粒發(fā)生了有效編輯，通過T-A克隆和單克隆測(cè)序分析可知，在35個(gè)單克隆中有8個(gè)發(fā)生了基因編輯，綜合考慮轉(zhuǎn)染效率，其基因編輯效率為74.7%。針對(duì)10個(gè)易脫靶位點(diǎn)進(jìn)行

9、了PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的測(cè)序，結(jié)果表明這10個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生基因編輯現(xiàn)象，可知pX458-site2具有較好的靶向性。
　　二、CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)于不同細(xì)胞系的編輯情況存在差異
　　將pX458-site2分別轉(zhuǎn)入HEK-293、Hela、SW480細(xì)胞系，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率如下：HEK-293為29.4%，Hela為17.7%, SW480為21.9%。轉(zhuǎn)染72h后提取各組細(xì)胞的基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增

10、、T-A克隆、測(cè)序等系列實(shí)驗(yàn)可知：293細(xì)胞系的25個(gè)克隆中有5個(gè)發(fā)生了基因編輯，其中4個(gè)發(fā)生了A/T插入，且插入位點(diǎn)均位于PAM位點(diǎn)上游的第三個(gè)堿基處，編輯效率為68%；Hela細(xì)胞系的45個(gè)克隆中有1個(gè)發(fā)生了編輯，編輯情況為A/T堿基的插入，編輯效率為13.47%；SW480細(xì)胞系的56個(gè)克隆有4個(gè)發(fā)生了基因編輯，其中有兩個(gè)發(fā)生了A/T插入，且插入位點(diǎn)均位于PAM位點(diǎn)上游的第三個(gè)堿基處，基因編輯效率為32.7%。利用Pubmed網(wǎng)站

11、下載參與 NHEJ修復(fù)的基因（Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Ligase4、XRCC4、XLF、APTX、PNKP、APLF、TdP1、TdP2、Artemis、Metnase、WRN、Mre11、polλ、polμ、TDT），并設(shè)計(jì)出相應(yīng)的上下游引物，通過PCR擴(kuò)增后，對(duì)這些基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明這些基因在不同細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)確實(shí)存在差異性，為后續(xù)的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　三、CRISPR-Cas9系統(tǒng)的兩個(gè)腺

12、病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功
　　成功構(gòu)建出pDC315-U6+gRNA和pDC315-Cas9腺病毒穿梭質(zhì)粒。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建出了TRAC敲除質(zhì)粒，并證明pX458-site2具有較好的編輯效率，且通過檢測(cè)可知其脫靶率很低；在CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)不同類型人源細(xì)胞的基因編輯情況中，發(fā)現(xiàn)編輯效率和編輯結(jié)果有所差異，分析原因可能與參與NHEJ過程的基因表達(dá)差異有關(guān)，并對(duì)該推論進(jìn)行了初步的驗(yàn)證，證明了差異性的存在，該結(jié)果為今后不