基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的SND1基因敲除HeLa細胞穩(wěn)定株的制備與鑒定.pdf

1、研究目的：SND1，又稱為p100蛋白或Tudor-SN蛋白。最初研究發(fā)現(xiàn)其是EB病毒細胞核抗原2(Epstein-Barr virus nuclear protein2)的共活化因子。該蛋白在各物種中分布廣泛，在不同生物中具有高度的保守性，參與調(diào)控細胞的多種重要生理過程。SND1蛋白具有調(diào)節(jié)基因轉錄和剪接加工pre-mRNA的能力，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但到目前為止，SND1蛋白參與上述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的具體機制還不清楚，

2、有待于進一步研究。傳統(tǒng)的利用 siRNA干擾基因表達研究基因的方法不能在細胞中完全敲除 SND1基因的轉錄翻譯，導致 SND1蛋白不能完全從細胞中去除，影響對其功能的研究。最新的第三代基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9技術利用序列特異性的向導RNA分子引導核酸內(nèi)切酶Cas9對目標靶點的特異性結合與識別，并利用其活性中心對DNA雙鏈進行切割，從而完成對基因組的修飾與編輯。但傳統(tǒng)的 CRISPR/Cas9技術也存在脫靶效應。而改良的 CRI

3、SRP/Cas9基因編輯系統(tǒng)的 Cas9蛋白可以被改造成為特異性的切口酶，只在特定的DNA位點造成單鏈切口，從而激活細胞內(nèi)的同源重組(HR)機制，而又可以避免引起非同源末端連接(NHEJ)造成的基因突變，從而極大提高基因編輯的效率和精確性。因此我們利用最新的改良后的 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以實現(xiàn)在HeLa細胞中完全敲除SND1基因，同時又可以避免傳統(tǒng)方法導致的嚴重脫靶效應。從而構建HeLa細胞SND1基因敲除穩(wěn)定株，為后續(xù)

4、進一步研究敲除SND1的HeLa細胞對5-Fu化療藥物敏感性的影響以及對細胞周期的影響奠定基礎。
　　方法：由于人的 SND1基因第一個外顯子區(qū)和基因編碼區(qū)的重疊區(qū)域過短，不利于設計特異性的sgRNA。因此選取第二個外顯子區(qū)進行sgRNA設計。利用生物信息學手段設計一對特異性識別SND1基因第二個啟動子的上下游sgRNA，以包含CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)必需元件的PX462質粒為載體，構建出一對靶向SND1基因第二啟動子的上下

5、游序列的CRISPR/Cas9重組真核表達質粒。酶切和測序鑒定序列正確后，通過轉染試劑將這一對重組質粒同時轉染進入HeLa細胞中，24h后使用嘌呤霉素進行篩選，存活下來的為陽性細胞，然后通過有限稀釋培養(yǎng)的方法的篩選出陽性的單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)。最后用Western Blot鑒定敲除SND1基因的單克隆細胞。隨后，我們進一步利用免疫熒光法確認在HeLa細胞中完全敲除了SND1基因；利用CCK-8法進一步研究了敲除SND1基因的HeLa細

6、胞對5-Fu藥物敏感度的影響，利用流式細胞術研究了敲除SND1基因對HeLa細胞的細胞周期的影響。
　　結果：我們通過酶切和測序的方法驗證了設計的 sgRNA正確插入到表達CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)的PX462質粒載體中，轉染細胞后用嘌呤霉素篩選陽性單克隆細胞，提取蛋白利用Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)沒有SND1蛋白的表達；同時利用免疫熒光法檢測也發(fā)現(xiàn)完全敲除了 HeLa細胞的 SND1的表達。我們利用CCK-8法檢測了敲

7、除SND1蛋白的HeLa細胞對5-Fu敏感性的影響，結果表明當敲除細胞內(nèi)的SND1基因表達后，HeLa細胞對于5-Fu化療藥物敏感度增加，提示細胞內(nèi) SND1可能參與腫瘤細胞化療耐藥的產(chǎn)生。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)敲除HeLa細胞的SND1基因后，處于G1期細胞比例明顯增多，G2和S期細胞比例明顯降低，說明HeLa細胞敲除SND1基因后細胞周期被抑制。
　　結論：我們成功利用改良后的 CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)構建出 HeLa細胞