CRISPR-Cas9技術對綿羊肌肉衛(wèi)星細胞MSTN基因的靶向敲除研究.pdf

1、CRISPR/Cas9技術是一種新型的基因組靶向修飾技術，可以對生物體基因組特異位點進行定點改造。能夠高效的在靶位點產生DNA雙鏈缺口(Double-strand breaks，DSB)。通過有錯誤傾向的非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)機制修復，從而引入插入缺失突變。肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）是一類能夠在骨骼肌中特異表達，并對骨骼肌的生長起到負調控作用的糖蛋白，又被稱為

2、生長分化因子-8(Growth differentiation factor-8，GDF-8)，屬于轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族。MSTN基因的缺失或突變可引起動物出現“雙肌”性狀，促進動物肌肉的生長，提高產肉性能。利用CRISPR/Cas9技術制備MSTN基因敲除的綿羊肌衛(wèi)星細胞，為制備MSTN基因敲除綿羊個體提供了材料。
　　試驗設計了4組特異靶向綿羊MSTN基

3、因的靶位點，通過酶切連接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架載體中并對其測序驗證。通過酶消化法，分離培養(yǎng)了綿羊肌肉衛(wèi)星細胞，在形態(tài)學和分子生物學的角度對其進行驗證，并對其脂質體轉染條件進行優(yōu)化。將構建的載體轉染到細胞內，通過一代測序和SURVEYOR分析對載體的有效性和敲除效率進行檢測。運用極限稀釋的方法挑選基因穩(wěn)定敲除的細胞克隆，再通過TA克隆的方法確定基因突變類型，并對突變后的基因序列進行初步的生物信息學分析。
　　成功構建

4、了4個能夠靶向MSTN基因的特定位點的CRISPR/Cas9打靶載體。細胞誘導分化結果表明分離培養(yǎng)的細胞具有融合形成肌管的能力;RT-PCR結果表明肌衛(wèi)星細胞的特異表達基因MyoG、MyoD、Myf5等在細胞中均有表達，說明分離的細胞確為肌衛(wèi)星細胞。按照最優(yōu)轉染條件細胞轉染后，測序結果顯示pX330-target1和pX330-target4載體作用的靶位點處出現突變，SURVEYOR分析檢測其在靶位點產生突變的效率分別為24.20％和

5、10.18％。通過極限稀釋法，共獲得12個MSTN基因突變的細胞克隆，其中一株為純合突變。序列比對發(fā)現突變基因靶位點處一般有小片段堿基插入或缺失突變，部分會出現移碼突變。生物信息學分析表明:突變后的MSTN基因已經失去了原有的生物活性，該基因已被成功敲除。成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現了對綿羊MSTN基因的特異敲除，證明該系統(tǒng)可有效應用于綿羊的基因組編輯，獲得的具有穩(wěn)定突變的細胞克隆和構建的CRISPR打靶載體為后續(xù)制備MSTN