多肽與寡核苷酸偶聯(lián)純化方法及功能化寡核苷酸的應用研究.pdf

1、寡核苷酸是一類短鏈核苷酸，其具有很強的生物活性。通過指數(shù)富集的配基進化(SELEX)技術篩選出能與蛋白、小分子、離子、細胞等受體特異性結(jié)合的寡核苷酸具有特異性強、靈敏度高等特點，能用于各種生物傳感。同時，寡核苷酸可作為基因治療藥物或藥物前體。但寡核苷酸具有細胞通透性差、易被分解且與目標物親和力不強的缺點。而多肽具有分子量小，帶電量可調(diào)，抗酶水解等特點，將兩者進行偶聯(lián)既可以提高細胞的通透性還可以提高寡核苷酸的生物活性。近年來各種多肽篩選技

2、術尤其是噬菌體展示技術的發(fā)展，使得一大批具有識別、檢測和治療癌細胞功能的多肽不斷出現(xiàn)。這些多肽的發(fā)現(xiàn)給各種癌癥的診斷、治療帶來了新的思路和方法。將多肽與寡核苷酸進行有效地連接，可得到具有雙功能的生物分子，或具有協(xié)同治療作用能實現(xiàn)診療一體化的藥物。故多肽與寡核苷酸的偶聯(lián)物(POCs)，在生物傳感和癌癥治療方面都具有很高的實際應用價值。基于以上原因，本文開展了以下的工作:
　　1、利用了Click反應，EDC-NHS交聯(lián)羧基與巰基的直

3、接偶聯(lián)法和偶聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)，4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯(Sulfo-SMCC)偶聯(lián)的方法合成了不同性質(zhì)的多肽與寡核苷酸的偶聯(lián)物，在合成過程中對合成各條件進行優(yōu)化和改進，來提高反應效率。從理論和實踐中探討對合成效率有關鍵性影響的因素。討論了不同偶聯(lián)方法在合成多肽與寡核苷酸偶聯(lián)物中的優(yōu)缺點，并指出各種方法適用范圍及最適的反應條件。
　　2、為了尋求一種快速

4、、高效、規(guī)模化、標準化分離提純多肽與寡核苷酸偶聯(lián)物的方法，我們利用高效液相色譜(HPLC)、離子交換色譜(IEC)、聚丙烯酰胺凝膠切膠回收、透析、超濾、核酸酶酶切等方法將合成好的混合物進行提純，針對各種提純方法的特點進行討論并將其用于改進純化過程。對純化過程中遇到的各種問題進行分析和討論，總結(jié)給出了各種分離方法的優(yōu)缺點。最后，結(jié)合實驗原理和結(jié)果對各種方法的適用條件和范圍給出了合理的建議。該結(jié)果對以后純化不同POCs給出了明確的指導和建議

5、。
　　3、利用一條帶有BHQ1熒光淬滅基團的DNA與對Pb2+具有特異性的DNA酶鏈進行互補配對，當無Pb2+存在時向溶液中加入超電荷綠色熒光蛋白(scGFP)。由于正負電荷的吸引作用scGFP與DNA雙鏈靠近，綠色熒光蛋白的熒光被BHQ1淬滅。當存在Pb2+時，Pb2+能特異性識別DNA雙鏈中含有RNA的位點并將其切割，切割后的含有BHQ1的短鏈DNA從雙鏈上脫離并游離到溶液，此時再加入scGFP，游離到溶液中的BHQ1無法淬