基于鐵調(diào)素探討斷藤益母湯對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨代謝的影響及作用機(jī)制.pdf

1、背景：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性進(jìn)行性對(duì)稱性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。RA的主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的滑膜炎、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成，骨破壞是其最常見的并發(fā)癥，常累及軟骨及骨質(zhì)，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，甚至關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞而引起畸形、功能障礙，從而增加了RA致殘率，其危害性非常嚴(yán)重。因此，延緩甚至阻斷骨破壞已成為治療RA的主要策略之一。大量研究認(rèn)為，RA的慢性

2、炎癥是導(dǎo)致其骨破壞的主要因素，但臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)RA患者即使在炎癥得到控制、病情完全緩解的情況下，部分RA患者在疾病后期仍出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞，即存在所謂的“炎癥與骨破壞分離”現(xiàn)象。在應(yīng)用抗風(fēng)濕藥控制RA病情活動(dòng)的同時(shí)，骨破壞依然存在，此外，雖有生物制劑能延緩骨破壞的報(bào)道，卻難以完全阻止骨破壞的進(jìn)展。因此，RA骨破壞的發(fā)生機(jī)制及治療方法有待于進(jìn)一步研究，以期能夠抑制RA骨破壞的發(fā)生發(fā)展。
　　鐵調(diào)素(Hepcdin，Hepc)是一種在鐵代謝

3、中起著重要作用的小分子多肽，其表達(dá)受多種因素影響，如血清鐵水平、促紅細(xì)胞生成素、低氧和氧化應(yīng)激等，在機(jī)體鐵代謝平衡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Hepc水平還受炎癥的調(diào)節(jié)，炎癥可以刺激Hepc的生成，在RA患者中血清Hepc水平異常升高，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鐵調(diào)素能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，上調(diào)破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因TRAP、CTK和MMP-9的表達(dá)。因此推測(cè)鐵調(diào)素可能參與了RA骨破壞的發(fā)生。
　　RA屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“痹證”的范疇，主要病機(jī)

4、為“肝腎虧虛、風(fēng)濕瘀阻”，其骨質(zhì)破壞是由于外邪內(nèi)侵，風(fēng)濕相搏，病久肝腎虧虛，筋脈失養(yǎng)，邪入脈絡(luò)，痰瘀交阻，侵害筋骨，以致關(guān)節(jié)變形，出現(xiàn)骨質(zhì)破壞。斷藤益母湯是針對(duì)此病機(jī)而確立，具有“補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)”的功效，可有效控制RA疾病活動(dòng)，但尚未對(duì)本方對(duì)RA骨代謝的影響進(jìn)行臨床觀察。
　　本研究來源于廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014A030313403)，擬通過臨床研究，觀察RA患者的骨代謝情況及Hepc的表達(dá)情況，及

5、Hepc與骨代謝的相關(guān)性;評(píng)估斷藤益母湯對(duì)RA患者臨床血清骨代謝指標(biāo)的影響;通過建立CIA大鼠模型，探討斷藤益母湯對(duì)RA骨破壞的影響及其作用機(jī)制。
　　一、臨床研究
　　目的:
　　觀察斷藤益母湯對(duì)RA骨破壞的臨床療效及安全性，通過對(duì)Hepc的水平進(jìn)行檢測(cè)，分析其與骨代謝的相關(guān)性，進(jìn)行斷藤益母湯治療RA骨破壞的機(jī)制探討。
　　方法:
　　納入74例RA患者及20例健康志愿者，將74例RA患者隨機(jī)分為對(duì)照組3

6、7例、試驗(yàn)組37例。對(duì)照組予甲氨蝶呤片治療，試驗(yàn)組予斷藤益母湯治療。檢測(cè)并比較RA患者與健康志愿者的血清鐵調(diào)素(Hepc)、Ⅰ型膠原羧基末端肽(β-CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、骨特異性堿性磷酸酶(BALP)水平。于治療后復(fù)查兩組RA患者的血清Hepc及骨代謝指標(biāo)，并進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算DAS28情況進(jìn)行病情活動(dòng)評(píng)價(jià)，分別在基線期及治療第4、8、12周記錄兩組患者的TJC、SJC、PGA、MDGA、ESR、CRP、S

7、DAI評(píng)分等疾病活動(dòng)指標(biāo)及安全性指標(biāo)，并觀察不良反應(yīng)方發(fā)生情況、記錄合并用藥情況，療程均為12周。
　　結(jié)果:
　　RA患者的血清Hepc、β-CTX、TRAP5b水平均較健康組升高，血清BALP水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，試驗(yàn)組DAS28有效率優(yōu)于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者治療后，TJC、SJC、PGA、MDGA評(píng)分均較治療前改善，對(duì)照組在第8周四項(xiàng)指標(biāo)開始改善（P＜0

8、.01），至第12周得到進(jìn)一步改善(P＜0.01)。試驗(yàn)組從治療后第4周開始改善(P＜0.01)，第8、12周得到進(jìn)一步改善(P＜0.01)。兩組TJC、PGA、MDGA比較，第4、8、12周時(shí)試驗(yàn)組均顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）;兩組SJC比較，第4、8周時(shí)試驗(yàn)組均顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01），但至第12周，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組疾病活動(dòng)指標(biāo)均較治療前得到明顯改善（P＜0.01），治療第4周試驗(yàn)組CRP、E

9、SR、SDAI評(píng)分均開始改善（P＜0.01或P＜0.05），第8、12周得到進(jìn)一步改善（P＜0.01）;對(duì)照組至第4周SDAI評(píng)分均開始改善，第8周CRP、ESR指標(biāo)開始改善（P＜0.01或P＜0.05），兩組CRP比較，第8周時(shí)試驗(yàn)組顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01），但至第12周，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;治療12周后，試驗(yàn)組ESR、SDAI評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。治療12周后，兩組患者Hepc、β-CTX、TR

10、AP5b均降低(P＜0.01)，且試驗(yàn)組Hepc、β-CTX、TRAP5b水平優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05），兩組治療前后BALP比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療前，RA血清Hepc水平與β-CTX、TRAP5b、BALP、ESR、CRP、SDAI均存在明顯正相關(guān)(P＜0.01，P＜0.05);治療后，RA血清Hepc水平與β-CTX、TRAP5b、ESR、CRP、SDAI均存在明顯正相關(guān)（P＜0.01），但與BA

11、LP無相關(guān)性（P＞0.05）。安全性分析提示，治療后，兩組患者WBC、PLT降低，RBC、HGB升高，其中兩組WBC及對(duì)照組PLT、RBC、HGB水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而試驗(yàn)組中RBC、HGB升高，PLT降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組中1例出現(xiàn)肝功能損害，試驗(yàn)組中4例女性患者出現(xiàn)月經(jīng)量少。
　　結(jié)論:
　　1.RA患者中Hepc水平升高，與骨吸收指標(biāo)存在明顯相關(guān)性。
　　2.斷藤益母

12、湯能夠在控制RA疾病活動(dòng)的同時(shí)，有效改善RA骨代謝水平，抑制骨破壞，其機(jī)制可能與抑制血清Hepc表達(dá)有關(guān)。
　　二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　目的:
　　觀察CIA大鼠中Hepc的表達(dá)情況及其與骨代謝的關(guān)系，評(píng)估斷藤益母湯對(duì)RA骨破壞的治療作用，并探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　選取65只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)取60只大鼠用于模型復(fù)制，其余5只大鼠作為空白對(duì)照組。造模成功后，將造模組隨機(jī)分為6組:正常組(Cont

13、rol)、模型組(Model)、AG490組、甲氨蝶呤組(MTX)、斷藤益母湯低劑量組(DTL)、斷藤益母湯中劑量組(DTM)、斷藤益母湯高劑量組(DTH)。各用藥組均連續(xù)給藥6周，在造模及用藥期間觀察大鼠的一般情況，每周進(jìn)行體重測(cè)量及大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritisindex AI)評(píng)估。末次給藥24h后，腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行血清Hepc、TRAP-5b、CTX-1檢測(cè)。取左側(cè)股骨用生理鹽水浸透的紗布包裹，用作Micro-CT檢測(cè)。取

14、右側(cè)股骨，用4％多聚甲醛固定，用于HE染色。分離雙側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織，進(jìn)行RT PCR及Westernblot檢測(cè)，觀察JAK/STAT通路中JAK2、STAT3的mRNA水平及p-JAK2、p-STAT3蛋白水平的變化。應(yīng)用STATA11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1.Wistar大鼠CIA造模成功率為56.7％。在初次免疫14-18天大鼠足部及踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，于初次免疫后第4-5周天左右達(dá)高峰，隨后腫

15、脹逐漸減輕，少數(shù)出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直，活動(dòng)受限，與RA病理過程相似，提示造模成功。
　　2.與Control組比較，Model組大鼠體重減輕，AI評(píng)分加重，骨顯微結(jié)構(gòu)受損，骨吸收指標(biāo)及血清Hepc水平升高，且二者存在正相關(guān)（Hepc與TRACP-5b的相關(guān)性:r=0.6483，P＜0.01; Hepc與CTX-1的相關(guān)性:r=0.7149，P＜0.01）。符合本研究所需的研究模型，以進(jìn)行進(jìn)一步的藥效及機(jī)制研究。
　　3.給予斷藤益母

16、湯干預(yù)后，大鼠體重增加（P＜0.05），關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分減低(P＜0.05)，股骨HE染色及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)改善（P＜0.05），骨吸收指標(biāo)下降(P＜0.05)，呈劑量依賴性，DTH組療效優(yōu)于MTX組。
　　4.斷藤益母湯治療后，大鼠血清Hepc下降（P＜0.05），呈劑量依賴性。
　　5.CIA大鼠炎癥發(fā)病過程中，JAK/STAT信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，JAK2、STAT3的mRNA及p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平

17、升高，以p-JAK2的蛋白表達(dá)上調(diào)明顯。
　　6.給予大鼠進(jìn)行AG490干預(yù)后，可明顯抑制JAK2基因及蛋白表達(dá)（P＜0.05），JAK2下游STAT3分子的mRNA及蛋白磷酸化明顯受抑制（P＜0.05），血清Hepc水平明顯下降（P＜0.05），股骨HE染色及股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)明顯改善（P＜0.05），骨吸收指標(biāo)下降(P＜0.05)。
　　7.斷藤益母湯能夠抑制JAK/STAT信號(hào)通路，下調(diào)JAK2、STAT3的mRNA

18、及p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在RA炎癥過程中，骨吸收指標(biāo)及Hepc的表達(dá)水平升高，并且二者存在明顯的正相關(guān)。
　　2.斷藤益母湯可有效改善RA病情、抑制RA骨破壞，其作用呈劑量依賴性。
　　3.RA發(fā)病過程中可能通過激活JAK/STAT信號(hào)通路，上調(diào)了鐵調(diào)素的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及功能，參與RA骨破壞發(fā)病過程。
　　4.斷藤益母湯可能通過抑制J