電離輻射在皮膚成纖維細胞WS1中誘導旁效應的應答機制研究.pdf

1、目的：
　　電離輻射誘導的旁效應指的是未受照射細胞在接受照射細胞傳遞的信號后產(chǎn)生的生物學變化。包括旁效應在內(nèi)的非標靶效應改變了放射生物學的傳統(tǒng)理論而成為廣為接受的新教義。旁效應的發(fā)生在低劑量輻射健康風險的評估、放療的療效及對正常組織的損傷等方面可能具有重要作用，因此已成為放射生物學領域的一個研究熱點。目前關于旁效應的研究主要集中在其發(fā)生的分子機制以及對機體造成的影響等方面。從旁效應發(fā)生的過程來看，它包括信號細胞受照后啟動關鍵的信號

2、通路，然后釋放旁效應信號，最后受體細胞接受旁效應信號產(chǎn)生生物學變化。本研究的主要目的是從受體細胞的角度來研究旁效應發(fā)生的分子機制。具體說來，首先要驗證X射線是否可以在人胚胎皮膚成纖維細胞WS1中誘導經(jīng)培養(yǎng)液介導的旁效應現(xiàn)象；然后進一步探究受α粒子照射的HaCat角質細胞與未受照射的WS1細胞共培養(yǎng)后，WS1細胞是否會發(fā)生旁效應，如果發(fā)生那么WS1細胞的應答機制又是什么，最后用HaCat細胞和WS1細胞簡單模擬構建人皮膚組織模型，為在半體

3、內(nèi)進一步深入研究電離輻射旁效應奠定基礎。
　　方法：
　　本研究采用條件培養(yǎng)液轉移和共培養(yǎng)兩種方法研究培養(yǎng)液介導的電離輻射旁效應。輻射方式包括X射線和α粒子。在第一部分中，以微核形成、DNA損傷（53BP1 foci）、細胞凋亡、增殖、活性氧水平和miR-21等指標確證X射線在WS1細胞中誘導經(jīng)條件培養(yǎng)液介導的旁效應；另用ELISA法定量檢測了條件培養(yǎng)液中TGF-β1含量的變化；第二部分主要是采用克隆形成實驗和53BP1 f

4、oci免疫熒光實驗對本實驗室自行設計的用于細胞生物學實驗的新型α粒子照射裝置進行驗證。在第三部分中，以ROS水平和53BP1 foci為指標檢測與受α粒子照射的角質細胞HaCat共培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞WS1發(fā)生的旁效應。更重要的是，采用細胞轉染改變WS1細胞miR-21的表達水平或通過外源性增加細胞SOD2的水平來細致地研究了旁效應細胞中的miR-21和SOD2在旁效應發(fā)生中的重要作用。第四部分，以鼠尾膠原蛋白為基質，將人胚胎皮膚成纖

5、維細胞WS1和人永生化角質細胞HaCat進行立體結構培養(yǎng)，簡單模擬人體皮膚組織的構成，并通過HE和免疫組化染色驗證三維組織的成功構建。
　　結果：
　　1. X射線可在WS1細胞中誘導經(jīng)培養(yǎng)液介導的旁效應。與新鮮培養(yǎng)液（Ctr）和未受照射條件培養(yǎng)液（SCM）對照組相比較，用1 Gy X射線照射后3小時的WS1細胞條件培養(yǎng)液（3 h RCM）處理未受照射的WS1細胞30分鐘后，旁效應細胞中ROS水平可升高11％；3 h RCM

6、處理旁效應細胞1小時后，53BP1 foci陽性細胞率增加了38%；3 h RCM處理旁效應細胞3小時后，旁效應細胞中miR-21的表達水平增加了1.38倍；3 h RCM處理旁效應細胞24小時后，微核形成率增加了44%，凋亡增加近一倍。此外還發(fā)現(xiàn)，與3 h SCM相比，3 h RCM中TGF-β1的含量增加了18%。在共培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)受照細胞與未受照細胞共培養(yǎng)1 h后旁效應細胞53BP1 foci的陽性細胞率增加了46%；共培養(yǎng)24

7、 h后，旁效應細胞WS1中微核形成率增加了34%。
　　2.自行設計的α粒子照射裝置可以用于生物實驗的研究。該裝置的計算模擬劑量率為0.14 Gy/min。以WS1細胞克隆率為指標，計算得出在細胞存活率為0.5時，α粒子相對于160 KeV的X射線的相對生物學效應為1.71。以53BP1 foci為指標檢測直接受α粒子照射的WS1細胞DNA損傷情況，發(fā)現(xiàn)分別照射0.28 Gy、0.56 Gy后可使53BP1 foci陽性細胞數(shù)分別

8、增加0.38倍和1倍，并且顯示出DNA損傷的非均一性。
　　3.受α粒子照射的HaCat角質細胞可在未受照WS1細胞中誘導經(jīng)培養(yǎng)液介導的旁效應，并且WS1旁效應細胞中的miR-21和SOD2對旁效應的產(chǎn)生起著非常重要的調控作用。未受照射的旁效應細胞WS1與受照射的信號細胞HaCat共培養(yǎng)30分鐘后，WS1細胞中ROS水平上升了15%；共培養(yǎng)3小時后，53BP1 foci(DNA損傷常用標記）增加了1.4倍，表明與照射過的角質細胞H

9、aCat共培養(yǎng)后，旁效應細胞WS1中發(fā)生了氧化應激和DNA損傷。并且，與受照HaCat細胞共培養(yǎng)3小時后，旁效應細胞WS1中miR-21的表達水平升高，而在WS1細胞中下調miR-21水平可使旁效應現(xiàn)象消除，而僅僅單獨過表達miR-21就可誘導與旁效應類似的氧化應激和DNA損傷。這些數(shù)據(jù)表明，本系統(tǒng)中，miR-21在旁效應的調控中起著重要作用。另外，MnSOD（SOD2）也參與了對WS1細胞旁效應的調控，過表達SOD2可解除旁效應誘導的

10、氧化應激和DNA損傷，提示SOD2在電離輻射誘導旁效應的發(fā)生中可起到重要作用。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)miR-21可調控SOD2。
　　4.構建人皮膚組織三維模型。利用人胚胎皮膚成纖維細胞WS1和人永生化角質細胞HaCat構建了一個多細胞體系實驗模型，從而簡單地模擬了人體正常皮膚組織結構。HE染色結果顯示HaCat細胞分化為層狀結構；在X射線照射后，免疫組化染色顯示的53BP1 foci證實三維皮膚組織中細胞的DNA損傷。除此之外還構建

11、了穩(wěn)定表達SOD2的WS1細胞株，進而可用穩(wěn)定表達SOD2的WS1細胞與HaCat細胞構建三維皮膚模型。
　　結論：
　　本研究證實X射線可在WS1細胞中誘導經(jīng)培養(yǎng)液介導的旁效應。并且WS1細胞還可接受受α粒子照射的HaCat細胞釋放的旁效應信號從而產(chǎn)生旁效應。從未受照射細胞的視角來看，WS1細胞中的miR-21和SOD2對旁效應的發(fā)生起著至關重要的作用，而且miR-21可能通過對SOD2的調控來調控著旁效應的發(fā)生。具體說來