P2X7受體介導的HEK293細胞活化與凋亡機理研究.pdf

1、嘌呤受體分為P1和P2兩大類。P1受體主要由A(腺苷)激活，P2受體主要由ATP等激活。P2受體主要又分為P2X和P2Y。P2X受體家族是一類對鉀、鈉和鈣可通透的離子通道，P2Y受體家族是與G-蛋白相偶連的受體，與磷脂酶C的激活和肌醇三磷酸的形成有關。目前已克隆出7個不同的P2X亞型，分別稱為P2X1-7，P2X7又稱P2Z。P2X7受體特性與其他六個亞型不同；體外電生理實驗表明ATP短暫刺激該受體可引起非選擇性小陽離子瞬時通透；如果A

2、TP反復或持續(xù)刺激該受體既可引起非選擇性質膜孔道開放，最終導致細胞凋亡。雖然P2受體廣泛地分布機體各組織器官，以往認為P2X7是唯一被證實分布于小膠質細胞的P2嘌呤受體。目前免役組織化學一般檢測不出來，正常條件下免疫組織化學顯示出的陽性細胞一般為神經(jīng)細胞，而且比較淺淡。細胞外ATP可通過P2X受體可以激活膠質細胞。在體內，細胞外ATP濃度很低，不足以激活膠質細胞，表達更多的P2X受體。而細胞內ATP濃度較高，后者是前者的1000倍，達毫

3、摩爾水平。在某些病理條件下如腦外傷、缺血、炎癥等局部細胞受到損傷而釋放出大量ATP及降解產(chǎn)物，它們在局部的濃度很高，而且會向鄰近區(qū)域擴散，它們將較長時間地刺激損傷區(qū)和其鄰近區(qū)的膠質細胞，這足以激活膠質細胞，并使其P2X受體表達上調。小膠質細胞激活后可肥大、增生，形成典型的吞噬細胞，可產(chǎn)生許多生物活性物質如活性氧、一氧化氮、蛋白酶及一些炎性物質對周圍細胞產(chǎn)生損害作用；但另一方面又產(chǎn)生轉化因子beta1和神經(jīng)生長因子等物質促進神經(jīng)組織再生及

4、修復?；罨男∧z質細胞在腦外傷、缺血、炎癥、AIDS、多發(fā)性硬化病、蛋白病毒病、退行性病變如Alzheimer及Parkinson氏病以及衰老等過程中起很重要的作用。 盡管上述病理過程均與小膠質細胞活化有關，但小膠質細胞被激活的機制還不太清楚。綜合本研究和以往文獻資料，P2X7參與小膠質細胞的激活和凋亡效應。如果用特異性拮抗劑阻斷ATP的作用，將阻止小膠質細胞和星形膠質細胞激活后所帶來的對周圍組織細胞的損害作用和膠質疤痕的形成

5、，從而保護腦組織不受進一步的損害或有利神經(jīng)纖維的再生。 本研究首先使用大鼠P2X7受體基因(GB號X95882)與EGFP基因融合構建了真核表達重組質粒pcDNA3-hi-EGFP-rP2X7。在此基礎上，轉染人HEK293細胞，使用G418作為篩選劑，在0.8mg/ml濃度下，經(jīng)過單克隆化，建立了穩(wěn)定表達P2X7受體和EGFP的HEK293細胞細胞株，經(jīng)胞外ATP刺激的功能分析和免疫組織化學等測試，該細胞株正確表達P2X7受

6、體并穩(wěn)定傳代50代以上。 我們使用上海生物芯片公司的人14k基因表達譜cDNA芯片(SHC-R-HC-100-20)，分析了細胞外ATP在不同濃度和時間條件下，通過活化此轉染細胞株后所導致的基因表達變異譜并使用RT-PCR等方法進行了進一步的驗證。差異表達基因篩選標準為Ratio＞=2或＜=0.5，F(xiàn)lags為P，SN＞2，除去質控點、不顯著表達及無信號等數(shù)據(jù)點，在0.05mmol/LATP試驗組中，有46個基因顯著上調，而顯

7、著下調的有2個；0.1mmol/LATP試驗組中，有35個基因顯著上調，而顯著下調的有1個；0.4mmol/LATP試驗組中，有51個基因顯著上調，而顯著下調的有13個；0.8mmol/LATP試驗組中，有93個基因顯著上調，而顯著下調的有8個。就基因顯著表達的數(shù)量而言，總體上反映了隨著胞外ATP濃度的增高，受P2X7受體介導，基因表達有活躍的趨勢。表達顯著下調的基因極少，胞外ATP所導致濃度計量效應極為明顯。在挑選出的160個顯著差異

8、(含上調與下調)的基因中，基因受ATP濃度影響的趨勢亦十分明顯。 我們對其中的16條基因進行了RT-PCR驗證，其中ATF3、BTG2、V-FOS、TGF1、HRK、BCL2、DUSP1、GADD45A、FBJ、STC2、SGK的結果與芯片的表達一致。這些基因涉及細胞周期、細胞凋亡、細胞信號轉導等方面。其中大部分基因是首次發(fā)現(xiàn)與P2X7的調節(jié)顯著相關。 在蛋白質組學方面，通過使用Ciphergen公司具有疏水反相性質

9、的CM10蛋白質芯片，結合SELDI-TOF質譜分析，發(fā)現(xiàn)細胞外ATP在不同濃度下，通過P2X7受體活化的HEK293轉染細胞株所導致的蛋白表達譜有明星的變異，經(jīng)Biomark軟件分析，0mmol/LATP試驗組共有93個不同質荷比的峰值(P＜0.1)；0.1mmol/LATP試驗組共有188個不同質荷比的峰值(P＜0.1)；0.8mmol/LATP試驗組共有279個不同質荷比的峰值P＜0.1)。從不同濃度試驗組的峰值數(shù)量而言，隨著胞外

10、ATP逐漸增高，P2X7受體/HEK293細胞所表達的蛋白質數(shù)量有明顯增多的趨勢。 0.0mmol/LATP、0.10mmol/LATP和0.80mmol/LATP三個試驗組中，隨著胞外ATP的濃度增高，樣品中M/Z值分別為3551.9、3939.1、4127.3、4282.1、5353.9、6272.3、6541.5的7個峰值出現(xiàn)明星的上升趨勢(組間比較，P＜0.02)。而0.0mmol/LATP、0.10mmol/LATP