2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、Na+-牛黃膽酸共轉運多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)屬于SLC10轉運體家族,是家族中發(fā)現(xiàn)的第一個轉運體蛋白,基因命名為SLC10A1。NTCP特異性表達于肝細胞基底側膜,參與膽酸鹽的肝腸循環(huán),負責將膽酸鹽,尤其是結合型膽酸鹽,從血漿中攝取進入肝細胞,以維持機體的膽酸鹽平衡。雖然NTCP在機體內(nèi)的膽酸鹽攝取功能存在有機陰離子轉運多肽(Organicanion tr

2、ansporting polypeptides,OATPs)轉運的代償機制,但NTCP的功能并不是完全可以替代的。當NTCP轉運功能受阻時,依然可能發(fā)生嚴重的臨床癥狀。近年來研究發(fā)現(xiàn),NTCP是乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis D virus,HDV)進攻肝細胞的特異性受體,揭示了NTCP新的角色。干擾素類和核苷類似物治療HBV遇到了副作用強和病毒耐受的問題,HBV和HDV特異性

3、受體的發(fā)現(xiàn)為肝炎的治療開辟了新途徑。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)HBV結合NTCP與普通化合物結合NTCP存在相互競爭的現(xiàn)象,環(huán)孢菌素A為NTCP的經(jīng)典抑制劑,研究發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素A及其衍生物可以通過靶向NTCP達到抑制HBV感染的目的。這些研究結果顯示,NTCP的底物或抑制劑可成為研發(fā)治療HBV藥物的新思路。同時,也提示我們已有的一些具有保肝作用的藥物,其作用機制可能與NTCP的相互作用有關。因此,建立穩(wěn)定表達NTCP的體外細胞模型,用于快速

4、篩選NTCP的潛在抑制劑/底物,以及用于研究藥物與NTCP的相互作用,具有非常重要的意義。本課題成功構建了穩(wěn)定表達人NTCP的LLC-PK1細胞模型,并將其應用于他汀類、雙胍類藥物與NTCP相互作用研究以及篩選潛在的中藥化學成分,發(fā)現(xiàn)了多個對NTCP具有抑制作用的化學分子。本研究主要內(nèi)容包括:
 ?、湃薔TCP表達質粒的構建。以人基因組DNA為模板擴增得到NTCP基因片段,將其連接到改造后、具有可用酶切位點的慢病毒載體PCDH-C

5、MV上,得到PCDH-CMV/NTCP表達質粒。
 ?、品€(wěn)定表達人NTCP的LLC-PK1細胞模型的構建。利用慢病毒包裝感染技術,將PCDH-CMV/NTCP表達質粒經(jīng)病毒感染進入LLC-PK1宿主細胞中,并最終將NTCP目的基因整合入宿主染色體中。利用有限稀釋法挑取得到單克隆細胞株,通過GFP綠色熒光對單克隆細胞株進行篩選,除去沒有綠色熒光或熒光強度較弱的細胞株,經(jīng)初篩得到9株單克隆細胞(編號為1-9號)。利用熒光定量PCR技術

6、檢測9株單克隆細胞中NTCP mRNA的表達水平,發(fā)現(xiàn)9株細胞的mRNA表達水平均明顯高于mock細胞。通過NTCP的經(jīng)典底物牛黃膽酸鈉(Sodium taurocholate hydrate,TCNa)驗證單克隆細胞中NTCP的轉運活性。經(jīng)細胞攝取實驗發(fā)現(xiàn),各單克隆細胞株對TCNa的攝取量均顯著高于mock細胞,且受到抑制劑環(huán)孢菌素A的抑制,而mock細胞則不受影響。1-9號單克隆細胞株攝取量各不相同,且與其mRNA表達水平并不完全一

7、致。選取攝取量最大的1號細胞株,考察了其對TCNa攝取的時間依賴性,發(fā)現(xiàn)在5 min內(nèi)攝取呈線性。以3 min為孵育時間,研究了TCNa在細胞中的積聚動力學,結果表明其符合米氏方程,米氏常數(shù)Km和最大轉運速率Vmax分別為:42.0μM和0.92 nmol/mgprotein/min,且積聚量遠遠大于mock細胞。實驗結果充分表明穩(wěn)定高表達人NTCP的LLC-PK1細胞模型構建成功。
 ?、撬☆?、雙胍類與人NTCP相互作用的研究

8、。實驗研究了100μM氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、瑞舒伐他汀、普伐他汀、苯乙雙胍和25μM二甲雙胍對于NTCP攝取TCNa的抑制作用。發(fā)現(xiàn)雙胍類藥物對NTCP沒有抑制作用,他汀類藥物中氟伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀抑制作用較明顯??紤]到三種化合物的細胞毒性,分別在0-100μM和0-200μM濃度范圍內(nèi)考察了辛伐他汀、氟伐他汀和洛伐他汀的濃度依賴性抑制,發(fā)現(xiàn)三者均呈現(xiàn)較好的濃度依賴性,辛伐他汀、洛伐他汀和氟伐他汀抑制的IC50值分別為:

9、40.1μM,146.9μM和301.7μM,與三個化合物的脂溶性趨勢相一致。通過研究三者對NTCP攝取TCNa動力學參數(shù)的影響,發(fā)現(xiàn)氟伐他汀可使TCNa的Km值由42.0μM增加到528.6μM,而Vmax值基本不變。證明氟伐他汀為NTCP的競爭性抑制劑。
 ?、戎兴幓瘜W成分中人NTCP潛在抑制劑/底物的篩選。實驗篩選了103種中藥化學成分,包括丹參酮類、五味子素類、皂苷類、葸醌類、生物堿類、銀杏內(nèi)酯與銀杏酚酸類、香豆素類、黃酮

10、類等多種中藥化學成分類型,觀察到10種化合物:赤蘚紅B、黃芪甲苷、GA(13∶0)、GA(15∶1)、GA(17∶1)、槲皮素、大黃素、水飛薊賓、金絲桃苷和黃豆苷元,對NTCP攝取TCNa產(chǎn)生抑制作用。經(jīng)過進一步的濃度依賴性抑制的研究,發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸類的抑制作用較強,GA(13∶0)和GA(15∶1)兩種化合物的IC50值均小于15μM,分別為:8.3μM和13.6μM。大黃素、GA(17∶1)、赤蘚紅B和水飛薊賓抑制作用較弱,IC50值

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