豬IFITM3基因Piggybac載體構(gòu)建及其在PK15細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、干擾素是種具有抗病毒、抑制細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)免疫和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，干擾素通過與其受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)干擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes,ISGs)產(chǎn)生，表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)從而完成多種生物學(xué)功能。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein3，IFITM3)基因是一種重要的干擾素刺激基因。IFITM3具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、細(xì)胞

2、增殖和抵御病毒入侵等多種生物學(xué)功能。目前對于IFITM3基因的研究主要集中在人和鼠方面，著重于IFITM3基因在腫瘤組織和癌細(xì)胞中表達(dá)豐度的變化。有關(guān)豬IFITM3基因的研究集中在其抗病毒作用方面，具體機制尚不清楚。PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子能快速高效地將目的基因插入真核細(xì)胞基因組中，為在細(xì)胞中評價目的基因的功能提供了便利。
　　本文旨在構(gòu)建豬IFITM3基因的PB轉(zhuǎn)座子重組載體，并初步在PK15細(xì)胞中對其表達(dá)進(jìn)行評價，為進(jìn)一

3、步研究該基因在細(xì)胞水平的抗病毒機制奠定前期實驗基礎(chǔ)。利用RT-PCR方法從豬脾臟組織中對IFITM3基因ORF區(qū)進(jìn)行克降，分析IFITM3基因在豬各組織中的表達(dá)，以pET-21b(+)為骨架構(gòu)建原核重組表達(dá)載體，利用SDS-PAGE和Western Blot分析IFITM3基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)，用PB轉(zhuǎn)座子構(gòu)建真核重組表達(dá)載體PB-IFITM3，將IFITM3基因轉(zhuǎn)染整合到PK15細(xì)胞基因組中，QRT-PCR方法檢測IFITM3等

4、基因在PK15細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平，評價IFITM3基因過表達(dá)對LPS介導(dǎo)的炎性信號分子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:克隆的豬IFITM3基因長度為438 bp，編碼145個氨基酸;IFITM3基因在豬脾臟和肺臟中表達(dá)豐度較高;原核表達(dá)載體所表達(dá)的蛋白大小為22.3ku，其中部分為可溶性蛋白，另一部分以包涵體形式存在;構(gòu)建了PB-IFITM3真核重組表達(dá)載體，實現(xiàn)了IFITM3基因在PK15細(xì)胞中的過表達(dá);QRT-PCR結(jié)果顯示:IFITM