假單胞菌M18 gacS和gacA基因的克隆、蛋白表達與純化研究.pdf

1、上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文假單胞菌假單胞菌M18gacS和gacA基因的克隆、蛋白表達與純化研究基因的克隆、蛋白表達與純化研究學(xué)校：學(xué)校：上海交通大學(xué)院系：院系：生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院碩士生：碩士生：任慧娟專業(yè)：專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)導(dǎo)師：導(dǎo)師：李榮秀教授、董德賢副研究員上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2010年1月月上海交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文假單胞菌假單胞菌M18gacS和gacA基因的克隆、基因的克隆、蛋白表

2、達與純化研究蛋白表達與純化研究摘要摘要感受激酶GacS(globalactivatsenskinase)和反應(yīng)調(diào)控因子GacA(globalantibioticcyanidecontrol)是雙元調(diào)控系統(tǒng)（twocomponentregulatysystem）的兩個組分。GacSGacA系統(tǒng)調(diào)控胞外生防因子和致病因子的合成，是抗生素等次級代謝產(chǎn)物合成所必需的。在許多革蘭氏陰性菌中，保守的雙組分調(diào)控系統(tǒng)GacSGacA對細菌胞外產(chǎn)物的合成

3、與分泌具有決定性的控制作用。如在一些植物、動物和人的病原菌中，當(dāng)gacS或者gacA基因發(fā)生突變時，突變株的多種胞外產(chǎn)物分泌受到不同程度的抑制，對植物、動物和人的致病性也顯著降低。目前對GacS、GacA蛋白的研究主要是對gacS、gacA基因突變，分析突變對細胞胞外產(chǎn)物等各個方面的影響。尚無對GacS、GacA蛋白的直接獲得及研究。因此，gacS、gacA的克隆、表達與純化及深入的研究是一個極富意義的研究領(lǐng)域。本課題對雙元調(diào)控系統(tǒng)的g

4、acS和gacA進行克隆、蛋白表達與純化研究。以假單胞菌M18全基因組為模板，pET28b（）為載體，克隆gacS、gacA基因。將重組質(zhì)粒pETgacA經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中IPTG誘導(dǎo)表達，GacA蛋白得到可溶性表達。表達產(chǎn)物經(jīng)金屬螯合層析柱純化，蛋白純度約為95%，MALDITOF鑒定證明純化的蛋白為假單胞菌M18GacA蛋白。對GacA進行熱穩(wěn)定性分析，GacA蛋白不耐高溫，40℃10min即變性沉淀。GacA