HIV-1與宿主因子TSG101和Alix的相互作用研究.pdf

1、目的：
　　 研究HIV-1感染對細(xì)胞內(nèi)宿主因子TSG101和Alix表達(dá)的影響，以及中國流行毒株特異性的Gagp6蛋白中央?yún)^(qū)連續(xù)7個(gè)氨基酸缺失的基因突變模式(30PIDKELY36)對HIV-1與TSG101和Alix相互作用的影響。
　　 方法：
　　 1以HIV-1感染性克隆病毒pNL4-3感染TZM-bl、PM1、Jurkat細(xì)胞株和人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，以未感染細(xì)胞為空白對照，感染24h后收

2、獲細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測在RNA水平各因子的表達(dá)差異；感染48h后收獲細(xì)胞提取總蛋白，Western-blot檢測各因子在蛋白水平的表達(dá)差異。
　　 2利用Overlap-PCR方法分別對△EnvpNL4-3（缺失Env的B亞型克?。┖?09N14（CRF07_BC全長克隆）的Gag/p6基因區(qū)進(jìn)行21個(gè)堿基的缺失突變（缺失PIDKELY序列），獲得相應(yīng)突變克隆株。突變與野生型克隆病毒質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株，

3、分別檢測兩種亞型野生型和突變性病毒Gag蛋白表達(dá)情況，同時(shí)，Western-blot檢測Gag蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TSG101、Alix與Gag/p6蛋白的表達(dá)情況；以免疫共沉淀檢測TSG101、Alix與Gag/p6蛋白的結(jié)合情況。
　　 結(jié)果：
　　 1HIV-1感染對原代PBMCs與細(xì)胞系表達(dá)Alix與TSG101影響顯著不同，細(xì)胞系主要表現(xiàn)為下調(diào)，而原代PBMCs主要表現(xiàn)為TSG101上調(diào)；細(xì)胞系中的下調(diào)又細(xì)分為Jur

4、kat細(xì)胞的Alix與TSG101的雙下調(diào)、TZM-bl細(xì)胞的Alix單下調(diào)以及PM1細(xì)胞無影響三種情況。
　　 2突變的HIV-1Gag/p6蛋白與Alix的結(jié)合能力強(qiáng)于野生型的Gag/p6蛋白：突變與野生型HIV-1Gag/p6蛋白與TSG101的結(jié)合能力沒有明顯差別。
　　 結(jié)論：
　　 1首次報(bào)道了HIV-1感染對宿主細(xì)胞TSG101和Alix分子表達(dá)的影響，HIV-1感染調(diào)節(jié)Alix與TSG101的機(jī)制